Диссертация (Структура и пероксидазная функция комплекса цитохрома c с кардиолипином в водной среде и в неполярном окружении), страница 5
Описание файла
Файл "Диссертация" внутри архива находится в папке "Структура и пероксидазная функция комплекса цитохрома c с кардиолипином в водной среде и в неполярном окружении". PDF-файл из архива "Структура и пероксидазная функция комплекса цитохрома c с кардиолипином в водной среде и в неполярном окружении", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "биология" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве РНИМУ им. Пирогова. Не смотря на прямую связь этого архива с РНИМУ им. Пирогова, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата биологических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст 5 страницы из PDF
Однако стоит указать, что в клетках с дефицитом цитохрома cокисления кардиолипина не бывает, и апоптоз не развивается [15].2.2.3 Взаимодействие цитохрома c с кардиолипиномИзучениеспособностицитохромаcобразовыватькомплекссфосфолипидами берёт своё начало в конце третьей четверти XX века [98].Амфифильные молекулы, такие как кардиолипин или додецилсульфат,связываясь с цитохромом c, изменяют его конформацию, что приводит в томчисле к разрыву координационной связи >Fe∙∙∙S(Met80), причём активацияпероксидазной активности цитохрома происходит в строгом соответствии сразрывом связи.
При этом эффект кардиолипина гораздо сильнее, чемдодецилсульфата [24]. Сродство фосфолипидов, в частности кардиолипина, кцитохрому c обеспечивается наличием отрицательно заряженных групп,которые могут взаимодействовать с положительно заряженными поверхностиостатками лизина на поверхности цитохрома c [47, 164].Рис. 7 . Сайты связывания фосфолипидов в ЦитС лошади.a - Молекула ЦитС лошади с изображением сайтов связывания фосфолипидов: сайт A(розовый), сайт C (бирюзовый), сайт L (жёлтый).b - Рельеф поверхности структуры цитохрома c [80].На поверхности цитохрома c имеется несколько наиболее подходящихмест связывания КЛ, которые получили названия Сайтов A, С и L. Сайт А27содержит отрицательно заряженные остатки лизина Lys72 и Lys73 [92, 140,141].
Одним из методов изучения связывания в этом центре служит методспиновых меток. Так, определяя степень взаимодействия спин-меченого белкасо спин-мечеными фосфолипидами, было обнаружено, что поверхность белка,прилегающая к мембране, включает Lys72, Lys86 и Lys87 [110]. Аналогичнымобразом, исследования ЦитС дрожжей выявили участие Lys72 и Lys73 всвязывании ЦитС с КЛ [97]. Затем было показано, что на ЦитС существуетдополнительное место электростатического связывания, названное сайтом L,который включает Lys22, Lys25, His26, Lys27 и His33 и участвует в белковомембранных взаимодействиях при рН менее 7,0. Путем одновременноговзаимодействия сайтов L и A с мембранами, содержащими КЛ, ЦитС можетобразовывать комплекс цитохрома c с кардиолипином при низких значениях рН[101].Таким образом, на сегодняшний день аминокислотные остатки, входящиевсоставцентровсвязываниямолекулкардиолипинаокончательноопределились.
Сайт A включает в себя остатки Lys72, Lys73, Lys86 и Lys87;сайт C состоит из одного остатка аминокислоты – Asn52, и сайт L включает всебя аминокислотные остатки Lys22, Lys25, Lys27, His26 и His33. Сайты А и Lвзаимодействуютслипиднымиструктурамивосновномчерезэлектростатические взаимодействия, в то время как сайт C делает это черезводородные связи [92].Необходимо упомянуть, что связывание цитохрома c с кардиолипином наповерхности липидного бислоя ускоряет не только реакцию пероксидацииорганических соединений, но и другие реакции H2O2 с гемом: окислениецитохрома c (Fe2+), разрушение связи >Fe∙∙∙S(Met80) и системы сопряжённыхдвойных связей порфиринового кольца [23].2.2.4 Гипотезы о структуре комплекса Цит-КЛПервая гипотеза о структуре такого комплекса была высказана в 1977 годуБрауном и сотрудниками [49] и заключалась в том, что комплекс представляет28собой молекулу ЦитС с прилегающим участком липидного бислоя мембраны(MBC – мембранно-связанный цитохром с).Эта гипотеза в дальнейшем развивалась и использовалась в ряде работ [82,92, 120, 153].С другой стороны, в 2011 году Ю.А.
Владимиров и сотрудники наосновании данных, полученных с помощью исследования малоугловогорентгеновского рассеяния осадка, состоящего из комплекса цитохрома с скардиолипином, предложили совершенно другую схему строения комплекса,согласно которой молекула цитохрома с находится в центре наносферы иокружена монослоем из молекул кардиолипина [17]. Предложенная структурананосферы подразумевает возможность ее проникновения в липидный бислойклеточных и митохондриальных мембран благодаря своей гидрофобнойповерхности [19, 122]. Конечно, для проверки возможности существованиятаких наносфер (комплекса Цит-КЛ) недостаточно было только данных,полученных для кристаллического осадка комплекса – необходимо былодоказать существование таких наносфер в растворе.
Очевидно, что в связи свысокой гидрофобностью своей поверхности, в водном растворе комплексобразует осадок, поэтому раствор комплекса необходимо было получить вдостаточно гидрофобном растворителе.Авторы [92], приводят два потенциальных сайта связывания цитохрома c скардиолипином – Lys99 и Lys100. По данным из обзора [80], кардиолипинсвязывается с цитохромом c следующим образом: две алифатические боковыецепи взаимодействуют с сайтами A и C, происходит электростатическоевзаимодействие с остатками Lys72, Lys78, и Lys86. На сайте C имеетсягидрофобная«щель»,идущаякгему.Ацилвторойбоковойцепистабилизируется через водородную связь с Asn52 при одновременном обрывеводородных связей между соседними остатками His26 и Pro44. Было показано,что при замене связи >Fe∙∙∙S(Met80) на >Fe⋅⋅⋅S(Lys73) объём кармана гемаувеличивается и облегчается взаимодействие между кардиолипином и остаткомAsn52 [39].29В работе [39] описаны две возможные конформации цитохрома c вкомплексе с кардиолипином: одна напоминает естественную структуру, авторая – частично развёрнутую.
Эти конформации представлены на Рис. 8.Рис. 8. Структурный переход от Met80-Fe к Lys73-Fe в цитохроме c и его влияние насвязывание c кардиолипином [39].а - модель для перехода от Меt- к Lys-связанному гему была построена сиспользованием мутантов, которые представляют несколько промежуточныхконформеров, в том числе гидроксид-связанный гем. Конформационные изменения вглобуле, которые сопровождают начальные и конечные лигированные состояния,показаны стрелками.b - Сайты связывания кардиолипина А и С показаны пунктирными кругами.Указаны критические поверхностные остатки, необходимые для образованияводородных связей и введения ацила.c - Предложенный «карман» связывания кардиолипина.30Рис.
9. Два варианта конформаций цитохрома c, связанного с кардиолипином.Цифрами отмечены помеченные при исследовании флуорофорами наиболее гибкиеучастки (позиции 4, 39, 66 и 92) [82].На схеме, приведенной на Рис. 9, рассмотрены изменения конформациимолекулы цитохрома с при её связывании с поверхностью липидной мембраны.Схема является развитием концепции о мембранно-связанном ЦитС, котораябыла сформулирована Брауном и Вютрихом ещё в 1977 году [49]. Согласноэтому представлению, развитому в работах последующих авторов (см.
обзор[19]), молекула цитохрома c прикрепляется к молекулам кардиолипина наповерхности липидного бислоя за счёт электростатического притяженияположительных зарядов на белке и отрицательных – на головке фосфолипида,содновременнымгидрофобнымвзаимодействиемодной(илидвух)жирнокислотных цепей кардиолипина с белком, которые внедряются вбелковую глобулу и «заякоривают» белок на поверхности мембраны.Табл. 2.
Состав комплекса Цит-КЛ при различных значениях рН [19].Буферный20 Мм20 Мм20 Мм20 МмрастворKH2PO4KH2PO4KH2PO4KH2PO450 мМфталатныйбуферpH7,46,55,54,13,7КЛ:ЦитС59 ± 738 ± 513 ± 314 ± 313 ± 431Альтернативное представление о возможной структуре комплексацитохрома c с кардиолипином было предложено в работе [17], где былопоказано, что при добавлении небольшого объёма раствора кардиолипина вметаноле к концентрированному водному раствору цитохрома c выпадаетосадок с молярным отношением липид:белок, равным 35:1.
Впрочем, какпоказали более поздние исследования [19], это соотношение зависит от условийполучения осадка, в первую очередь от pH (см. Табл. 2).В работе [17] на кривых малоуглового рассеяния были обнаружены пики,соответствующими рефлексам первого, второго и третьего порядков,характерными для кристаллической ячейки кубической формы размером 11,2нм.
Сфера, вписанная в ячейку, имела, таким образом диаметр 11,2 нм. Ееможно назвать «наносферой». Было сделано предположение, что наносферасостоит из молекулы цитохрома c, окружённой монослоем кардиолипина,причём заряженные головки липида обращены внутрь, а гидрофобныеуглеводородные цепи – наружу (Рис. 10 б). Молекулярная моделькардиолипина даёт значение толщины монослоя 2,7–2,9 нм в зависимости отплотности упаковки молекул на поверхности раздела фаз; для двух монослоеввеличины будут соответственно 5,4–5,8 нм.
Вычитая среднюю из этих двухвеличину 5,6 нм из диаметра комплекса 11,2 нм, авторы получили диаметрмолекулы цитохрома c в комплексе, равный 5,6 нм, что заметно превышаетсредний диаметр молекулы цитохрома c в водной среде (≈4 нм). Такимобразом, глобула внутри наносферы, вероятно, была частично расплавлена(Molten globule). Изменение конформации белка в комплексе ЦитС-КЛпроявляется в следующем:1. Появляется флуоресценция тирозиновых и триптофановых остатков,которая была потушена в нерасплавленном цитохроме c из-за близостиэтих остатков к гему [47].2.
Исчезает полоса поглощения цитохрома c при 699 нм вследствие разрывакоординационной связи железа гема с серой метионинового остаткаMet80 в цитохроме c [24, 47].323. Появляется пероксидазная активность, которой исходный нативныйцитохром c практически не обладает [24, 47].4. Методом ИК-спектроскопии показано, что в комплексе с анионнымифосфолипидами у цитохрома с количество α-спиралей уменьшается: на3,46% для окисленного и 0,13% для восстановленного цитохрома; тогдакак количество β-структур при этом увеличивалось на 6,35% дляокисленного и на 0,92% для восстановленного цитохрома [19].Рис.
10. Две альтернативные схемы строения комплекса цитохрома с скардиолипином.а – Цитохром с прикреплён к поверхности мембраны, содержащей кардиолипин.Комплекс образуется в основном благодаря притяжению отрицательно заряженныхголовок кардиолипина к положительно заряженным группам на поверхности белка[49];б – схема комплекса Цит-КЛ как гидрофобной наносферы.