Диссертация (Структура и пероксидазная функция комплекса цитохрома c с кардиолипином в водной среде и в неполярном окружении), страница 10

Поэтому сказать, содержит ли метанольный растворрастворенный комплекс Цит-КЛ или липосомы, покрытые цитохромом c, исодержит ли водно-метанольная фаза также и частицы Цит-КЛ, на основанииданных ДСР невозможно.4.2.1.2 ЦитС в водном раствореС помощью метода ДСР мы определили диаметр частиц ЦитС в водномрастворе (Рис.

15), который составлял 3,6±1,0 нм, что по значению близко кразмерам ЦитС в белковых кристаллах или водных растворах, измеренным спомощью методов дифракции рентгеновского излучения и малоугловогорассеяния [173]. Как и ожидалось, при последовательных измерениях в однойпробе, измеряемый диаметр частиц изменялся незначительно (врезка на рис.14). Это говорит о том, что система содержит одинаковые частицы и чтоточность измерений достаточно высока.

В последующих измерения размеровчастиц с помощью метода ДСР мы придерживались точно такой же процедуры.58Диаметр частиц, нмКоличество частиц, %3,6±1,0Время, минДиаметр частиц, нмРис. 15. Распределение диаметров частиц в водном растворе ЦитС, полученноеметодом ДСР.Среднее значение диаметра показано вертикальной пунктирной линией.Концентрация ЦитС – 325 мкМ.Врезка: средние значения диаметров, полученных при последовательных измеренияхв одной пробе с водным раствором ЦитС.4.2.1.3 Цит-КЛ в неполярном окруженииКомплекс Цит-КЛ был получен из ЦитС и ТОКЛ (в молярномсоотношении 1:30) в водно-метанольно-хлороформенном растворе и затемпереведен в хлороформенно-метанольной фазу, после чего был измерен размерчастиц в пробе.

Средний диаметр частиц в пробе составил 10,9±0,9 нм, чтопрактически точно совпадает со значением в 11±1 нм, полученным длякристаллов Цит-КЛ [173]. Однако, в отличие от размеров частиц, полученныхпри последовательных измерениях в водном растворе ЦитС, в данном случаепри последовательных измерениях в одной пробе средние размеры частицварьировали в достаточно широком диапазоне значений (Рис. 16, врезка). Этоуказывает на то, что в пробе содержались частицы различных размеров.

Скореевсего, это объясняется тем, что Цит-КЛ содержал различное количествомолекул кардиолипина, прикрепленных к ЦитС.5910,9±0,9121086Диаметр частиц, нмКоличество частиц, %142520151050050100Время, мин420010203040Диаметр частиц, нмРис. 16. Распределение размеров частиц в хлороформенно-метанольном растворе ЦитКЛ.Среднее значение диаметра частиц показано вертикальной пунктирной линией.Врезка: средние значения диаметров, полученных при последовательных измеренияхв одной пробе с хлороформенно-метанольным раствором Цит-КЛ.Используя весь массив полученных данных, мы попытались выяснить,каковы размеры частиц, содержащихся в растворе комплекса Цит-КЛ. Былапостроена гистограмма (Рис. 17 А), на которой по оси ординат отложили числоизмерений, в которых значения среднего диаметра частиц попадали вдиапазоны шириной 1,5 нм.

По оси абсцисс отложили диаметры частиц. Быливыявлены три наиболее часто встречающиеся диапазона, в которые попадалиизмеренные средние диаметры частиц: 4,0 – 5,5; 7,0 – 8,5 и 11,5 – 13,0 нм(группы 1 – 3 на Рис. 17 А, соответственно). Из 34 проведенных измерений 4,5и 8 относились к группам 1,2 и 3, соответственно (Рис. 17 А). На Рис. 17 Ботражены распределения размеров частиц в группах измерений 1,2 и 3. Средниедиаметры частиц в группах составили: группа 1 – 4,7±0,75, группа 2 – 7,8±1,0,группа 3 – 12,1±1,4 нм.6020,5 – 2219 – 20,516 – 17,517,5 – 1914,5 – 1610 – 11,511,5 –1313 – 14,57 – 8,54 – 5,55,5 – 7≤4гр.28,5 – 10Количество измеренийгр.1Доля числа частиц ,%Aгр.3гр.1 гр.2гр.37,8±1.0 12,1±1,6.4,7±0,7БДиаметр частиц, нмСредний диаметр частиц, нмРис.

17. Результаты обработки данных, полученных при последовательныхизмерениях пробы, содержащей хлороформенно-метанольный раствор Цит-КЛ.(А) – Распределение средних значений размеров частиц, полученных впоследовательных измерениях.(Б) – Распределение значений размеров частиц в отобранных группах измерений.Логичным представляется сравнить полученные данные (Рис. 17 Б) срезультатами измерения кристаллов Цит-КЛ с помощью метода МУР.Удивительно, но размеры частиц Цит-КЛ, измеренные в хлороформеннометанольном растворе и в кристаллах, совпадают: 7,8±1,0 нм в растворе и8,0±0,7 нм в микрокристаллическом осадке [171], 12,1±1,4 нм в растворе и11,1±1,0 нм в микрокристаллах [173].

Мы видим, что в этих двух парах значенияразмеров частиц Цит-КЛ являются одинаковыми в пределах погрешностиизмерения.Данные о группе частиц 4,7 нм не поддаются однозначной интерпретации.Это могут быть молекулы ЦитС с измененной конформацией, в которойдополнительные гидрофобные группы оказались на поверхности глобулы,обеспечивая возможность растворения таких молекул ЦитС в гидрофобномрастворителе. В пользу такой гипотезы выступают данные о том, что подобнаяструктура наблюдается в ЦитС, помещенном на границу раздела фаза водавоздух [122], хотя для ее окончательного подтверждения требуютсядополнительные данные.61Обращаясь к Рис.

17 А, мы видим, что проба содержит частицы больших(>16нм) размеров. Они, скорее всего, представляют собой агрегаты частиц ЦитКЛ.4.2.2 Конформация цитохрома с в комплексе Цит-КЛДалеемырассмотримрезультатыспектрофотометрическогоиспектрофлуориметрического анализа растворов, содержащих комплекс ЦитКЛ, которые позволяют судить о состоянии железосерной связи в цитохроме си об удалении остатков тирозина и триптофана от гема внутри цитохрома с.Соотношение липид:белок в наночастицах оценивалось как отношениеколичества кардиолипина в растворе для приготовления Цит-КЛ к количествуцитохрома c в хлороформной фазе, определяемого спектрофотометрически попоглощению в максимуме 407 нм.

Оно составляло 60±10/1.4.2.2.1 Конформация ЦитС в комплексе Цит-КЛ, помещенном в гидрофобноеокружение.Для спектрофотометрического исследования комплекса Цит-КЛ вгидрофобном окружении смешивали 75 мкл 1 мМ ЦитС и 300 мклдистиллированной воды. Смесь перемешивали на перемешивателе типа Vortexпри 1200 об/мин 1 мин, отбирали от нее 25 мкл (для проведенияспектрофотометрических и спектрофлуорометрических измерений), добавляли280 мкл метанола и снова перемешивали. Затем добавляли к полученной смеси70 мкл 50 мМ ТОКЛ и перемешивали смесь, после чего отбирали 50 мкл смеси(для проведения спектральных исследований).

К оставшемуся растворудобавляли 650 мкл хлороформа, после чего перемешивали смесь наперемешивателе типа Vortex при 1400 об/мин в течение 3 мин. Полученнуюсмесь центрифугировали при 13000 об/мин в течение 2 мин, после чегоотделяли 500 мкл нижней фазы для спектрофотометрического анализа.62Как уже было сказано, в нативном состоянии ЦитС не флуоресцирует вводном растворе, однако при частичном плавлении глобулы в ЦитС начинаютфлуоресцировать остатки тирозина и триптофана [47, 100].На Рис.

18 А представлен спектр испускания флуоресценции раствора ЦитКЛ в гексане при использовании различных длин волн возбуждающего света.При возбуждении светом с длинами волн 268 и 275 нм наблюдаласьфлуоресценция как тирозиновых (максимум при 307-310 нм), так итриптофановых (максимум при 330 нм) остатков. При возбуждении светом сдлинами волны 282 и 289 нм в основном наблюдалась флуоресценция толькотриптофановых остатков (максимум при 330 нм). При этом, по обе стороны отмаксимума при 330 нм наблюдались так называемые «плечи» при 315 и 340 нм,что типично для индольного кольца в неполярном окружении [109].AИнтенсивностьфлуоресценции, о.еλвозб 268λвозб 275λвозб 282λвозб 289Длина волны, нм0,02Б0,016A6990,0120,00810,004026603680700720Длина волны, нмРис.

18. Спектры флуоресценции и поглощения комплекса Цит-КЛ в неполярнойсреде(А) – Спектры флуоресценции раствора Цит-КЛ в гексане при различных длинахволн возбуждающего света.(Б) – Поглощение железосерной связи в ЦитС в 50 мкМ (1) и 12,8 мкМ (2) растворахЦитС и растворе Цит-КЛ в гексане (3). Концентрация ЦитС в Цит-КЛ – 9,8 мкМ.63Как видно из Рис. 18 Б, плавление глобулы ЦитС в комплексе Цит-КЛ,помещенномхлороформенно-метанольнуюисчезновениемполосыпоглощенияприсреду,699нм,сопровождаетсяотносящейсяккоординационным железосерным связям между гемовым железом и серойметионина Met80.

Таким образом, конформация ЦитС в комплексе Цит-КЛизменена, за счет чего Цит-КЛ может приобретать ферментативную активностьи катализировать квази-липоксигеназные и липопероксидазные реакции [179].4.2.2.2 Влияние метанола на конформацию ЦитСВ предыдущем разделе для оценки частичного разрушения глобулы ЦитСиспользовались два критерия: исчезновение полосы поглощения при 699 нм ипоявление флуоресценции тирозиновых и триптофановых остатков.

Такаяфлуоресценция была также исследована и другими авторами при изученииЦитС в растворах, содержащих метанол и другие спирты [87, 181]. В этихработах было показано, что частичное разрушение глобулы, оцениваемоеразличными методами, наблюдается при объемных долях метанола от 45 до60% [87] или же от 40 до 70% [181], что сопровождалось увеличениеминтенсивности флуоресценции в диапазоне 320-400 нм при длине волнывозбуждающего света 280 нм [87]. В приведенных работах указаны толькозначения интенсивности флуоресценции, а не целые спектры флуоресценции, апоглощение света координационными железо-серными связями в ЦитС в нихвообще не рассматривается. В этой работе было проведено сравнение данных,полученных с помощью спектрофлуриметрии и спектрофотометрии в воднометанольных растворах ЦитС с данными, полученными в приблизительно техже условиях (концентрация ЦитС, температура и т.д.) с помощью тех жеметодов для Цит-КЛ, помещенного в неполярные растворители.64Поглощение, А0,17А0,15А6990,130,110,090,07670665699685728705725Длина волны, нм0,05БА6990,040,030,020,010103050Объемная доля метанола, %70Рис.