Диссертация (Структура и пероксидазная функция комплекса цитохрома c с кардиолипином в водной среде и в неполярном окружении), страница 12

Такая же картинанаблюдается и в случае с кумарином С-334 (Рис. 23)Схожая картина наблюдалась в случае с кумарином С-525 (данные неприведены)A1,41,21,430,820,60,40,231,21Поглощение, АПоглощение, АБ1,610,820,60,40,21100300350400450500550300600Длина волны, нм350400450500550600Длина волны, нмРис. 22. Спектры поглощения, подтверждающие отсутствие реакции между ЦитС икумарином C-314.А- Спектры поглощения при взаимодействии ЦитС и С-314. Кривая 1 – 10 мкМ ЦитС,2 – 25 мкМ С-314, 3- 10 мкМ ЦитС + 25 мкМ С-314.Б- Спектры поглощения при взаимодействии Цит-ТОКЛ и С-314. Кривая 1 – 10 мкМЦитС + 300 мкМ ТОКЛ, 2 – 25 мкМ С-314, 3- 10 мкМ ЦитС + 300 мкМ ТОКЛ + 25мкМ С-314.711,61,4A30,820,60,40,24500,820,60,410040010,2135031,21300Б1,4Поглощение, АПоглощение, А1,2500550300600Длина волны, нм350400450500550600Длина волны, нмРис.

23. Спектры поглощения, подтверждающие отсутствие реакции между ЦитС икумарином C-334.А - Спектры поглощения при взаимодействии ЦитС и С-334. Кривая 1 –10 мкМ ЦитС,2 – 25 мкМ С-334, 3- 10 мкМ ЦитС + 25 мкМ С-334Б - Спектры поглощения при взаимодействии Цит-ТОКЛ и С-334. Кривая 1 – 10 мкМЦитС + 300 мкМ ТОКЛ, 2 – 25 мкМ С-334, 3- 10 мкМ ЦитС + 300 мкМ ТОКЛ + 25мкМ С-334.4.3.1.3 Отсутствие непосредственного окисления С-314, С-334 и С-525пероксидом водородаВозможны следующие реакции в системе H2O2 + кардиолипин + С-334H2O2 + кумарин → PA,H2O2 + кумарин + ТОКЛ→ PAБыли проведены спектрофотометрические исследования в системах,содержащихА) 0 или 215 мкМ H2O2,Б) 25 или 12,5 мкМ кумарин (С-314, С-334 или С-525).Полученные данные для С-314 показаны на Рис.

24. Видно, что добавлениепероксида водорода не изменяло спектры поглощения С-314.72110,92Поглощение, А0,80,70,640,50,430,30,20,10300350400450500550600Длина волны, нмРис. 24. Спектры поглощения, подтверждающие отсутствие реакции между H2O2 и C314.1 – 25 мкМ С-314 + 215 мкМ H2O2,2 – 25 мкМ С-314,3 – 12,5 мкМ С-314 + 107,5 мкМ H2O2,4 – 12,5 мкМ С-314.На Рис.

25 показаны результаты аналогичного эксперимента с С-334.1,41Поглощение, А1,2210,830,640,40,20300350400450500550600Длина волны, нмРис. 25.Спектры поглощения, подтверждающие отсутствие реакции между H2O2 и C334.1 – 25 мкМ С-334 + 215 мкМ H2O2,2 – 25 мкМ С-334,3 – 12,5 мкМ С-334 + 107,5 мкМ H2O2,4 – 12,5 мкМ С-334.В этом случае имело место небольшое повышение поглощения в пикекумарина в смеси С-334 и H2O2 (Рис. 25, кривые 1 и 3) по сравнению с С-33473без H2O2 (Рис. 25, кривые 2 и 4. Это происходило при обеих исследованныхконцентрациях С-334.Устойчивым к прямому окислению пероксидом водорода оказался такжекумариновый сенсибилизатор С-525 (Рис. 26).0,72Поглощение, А0,610,50,430,340,20,10300350400450500550600Длина волны, нмРис. 26. Спектры поглощения, подтверждающие отсутствие реакции между H2O2 и С525.1 – 25 мкМ С-525 + 215 мкМ H2O2,2 – 25 мкМ С-525,3 – 12,5 мкМ С-525 + 107,5 мкМ H2O2,4 – 12,5 мкМ С-525.В этом случае имело место небольшое снижение поглощения в пикекумарина в смеси С-525 и H2O2 (Рис.

26, кривая 1) по сравнению с С-525 безH2O2 (Рис. 26, кривая 2), но это происходило только при концентрации С-525,равной 25 мкМ.Подводя итог данным, представленным на рисунках 24-26, можно сказать,что все три использованных кумариновых активатора хемилюминесценциилибо вообще не разрушается пероксидом водорода за время обычногоэксперимента с измерением кинетики хемилюминесценции, либо разрушаетсянастолько незначительно, что этим процессом можно пренебречь.744.3.1.4 Разрушениекумариновыхзондоввпероксидазнойреакции,катализируемой Цит-КЛ.Далее нами была получена зарегистрирована серия спектров поглощенияреакционной смеси для более полной оценки происходящих в изучаемойсистеме процессов (Рис.

27-Рис. 29). Красной пунктирной линией обозначенспектр поглощения смеси в отсутствии H2O2, первый измеренный спектрпоглощения обозначен красной линией, последний – чёрной, результатыизмерений между линий обозначены цветовым градиентным переходом изкрасного цвета через серый в чёрный; первая регистрация проходила через 15секунд после добавления H2O2.1,611,4Поглощение, А1,210,80,60,40,203501,64001,210,80,60,40,20010500121,4450Длина волны, нм2030405060Поглощение при 441 нм, АПоглощение при 409 нм, А300Время ,мин60055030,90,80,70,60,50,40,30,20,100102030Время ,мин405060Рис. 27.

Результаты измерения серии спектров поглощения смеси, в которойпротекает катализируемая комплексом ЦитС-ТОКЛ пероксидазная реакция вприсутствии C-314. Красная кривая – первое измерение, чёрная – последнее,промежуточные цвета (через серый) – промежуточные измерения.1. Серия спектров поглощения смеси: 10 мкМ ЦитС, 300 мкМ ТОКЛ, 25 мкМ C-314,215 мкМ H2O2, пунктирная красная кривая – спектр смеси без H2O2.2. Изменения значения оптической плотности в полосе Соре.3. Изменения значения оптической плотности в примерном пике поглощения C-314.На Рис.

27-1 показано изменение последовательно регистрируемых втечение 60 мин спектров поглощения смеси цитохрома c, кумарина С-314,75ТОКЛ и H2O2. Видно довольно быстрое разрушение ЦитС (поглощение при 409нм) и С-314 (поглощение при 441 нм). Кинетика разрушения показана на Рис.27-2 и Рис.

27-3, соответственно для этих объектов.Аналогично, на Рис. 28 представлены результаты исследования кумаринаС-334. Здесь мы наблюдаем картину, схожую с результатами исследованиякумарина С-314.1,411,2Поглощение, А10,80,60,40,2030035040045050055060021,41,41,210,80,60,40,200102030Время ,мин405060Поглощение при 452 нм, АПоглощение при 409 нм, АДлина волны, нм31,210,80,60,40,200102030Время ,мин405060Рис. 28. Результаты измерения серии спектров поглощения смеси, в которойпротекает катализируемая комплексом ЦитС-ТОКЛ пероксидазная реакция вприсутствии C-334. Красная кривая – первое измерение, чёрная – последнее,промежуточные цвета (через серый) – промежуточные измерения.1.

Серия спектров поглощения смеси: 10 мкМ ЦитС, 300 мкМ ТОКЛ, 25 мкМ C-334,215 мкМ H2O2, пунктирная красная кривая – спектр смеси без H2O2.2. Изменения значения оптической плотности в полосе Соре.3. Изменения значения оптической плотности в примерном пике поглощения C-334.Данные по разрушению цитохрома c и С-525 в пероксидазной реакции,катализируемой комплексом Цит-КЛ, приведены на Рис. 29. Оказалось, что«классический» физический активатор хемилюминесценции, так же как С-314и С-334, очень активно окисляется комплексом Цит-КЛ, при этом скорость76этого окисления ограничивается лишь концентрацией самого цитохрома c,который тоже разрушается в составе комплекса Цит-КЛ под действиемпероксида водорода (Рис.

29, кривые 1,2 и 3).1,611,4Поглощение, А1,210,80,60,40,2030035040045050055060011,621,41,210,80,60,40,200102030Время ,мин405060Поглощение при 441 нм, АПоглощение при 409 нм, АДлина волны, нм30,90,80,70,60,50,40,30,20,100102030405060Время ,минРис. 29. Результаты измерения серии спектров поглощения смеси, в которойпротекает катализируемая комплексом ЦитС-ТОКЛ пероксидазная реакция вприсутствии C-525.

Красная кривая – первое измерение, чёрная – последнее,промежуточные цвета (через серый) – промежуточные измерения.1. Серия спектров поглощения смеси: 10 мкМ ЦитС, 300 мкМ ТОКЛ, 25 мкМ C-525,215 мкМ H2O2, пунктирная красная кривая – спектр смеси без H2O2.2. Изменения значения оптической плотности в полосе Соре.3. Изменения значения оптической плотности в примерном пике поглощения C-525.Такимобразом,кумариновыеактиваторыхемилюминесценцииразрушаются в ходе пероксидазной реакции, катализируемой комплексом ЦитКЛ. Это обстоятельство следует иметь в виду при использованиихемилюминесцентных зондов при изучении образования свободных радикаловлипидов. Стоит, однако, добавить, что время инкубации в описанных вышеопытах (более часа) во много раз превышало время исследования кинетикипроцессов в большинстве опытов по измерению хемилюминесценции). В Табл.3приведенызначенияпродолжительности77ХЛ,сопровождающейсвободнорадикальные реакции, катализируемые Цит-КЛ в различных системах.ПриэтомподпродолжительностьюХЛподразумеваетсявременнойпромежуток, за который интенсивность ХЛ сначала увеличивается от фоновогоуровня до максимума, а потом вновь снижается до фонового уровня, т.е.

закоторый происходит изменение скоростей реакций в системе. Математическоемоделирование в рамках этого временного промежутка позволяет определитьконстанты скоростей соответствующих реакций [21, 22, 30, 31]. Для точногонахождения этих констант необходимо вводить поправки, которые можносделать исходя из данных по изменению концентраций цитохрома c исенсибилизаторов, аналогичных приведенным выше.Табл. 3. Продолжительность ХЛ*, сопровождающей свободнорадикальные реакции,катализируемые Цит-КЛ в различных системах.СистемаДлительность измерения ХЛ, мин*ЛипоксигеназнаяЛипопероксидазнаяреакцияреакцияВодный раствор36Гидрофобный растворитель88Суспензия митохондрий-8*Временной промежуток, в который интенсивность ХЛ сначалаувеличивается от фонового уровня до максимума, а потом вновьснижается до фонового уровня78Табл.

4. Степень разрушения кумариновых сенсибилизаторов за 8 минут после началапероксидации.Система содержала Цит-КЛ иРазрушениеследующий сенсибилизатор:кумарина, % *С-31429С-33439С-52548*n=5, p=0,95Введение таких поправок позволит точно проводить моделирование ирассчитывать константы скоростей реакций. Если этого не делать, торассчитанные константы скоростей будут изменены относительно реальных,так как скорости реакции зависит от концентраций их участников, которыеснижаются. В случае используемых нами кумаринов эта поправка будет,однако, небольшой, так как максимальное снижение концентрации заисследуемое время составило 48±4% (см Табл.

4). Таким образом, основныевыводыоконцентрациисвободнорадикальныхсвободныхреакций,радикаловполученныеприиоанализемеханизмекинетикисопровождающей эти реакции ХЛ, могут быть сделаны даже без пересчетов.4.3.2 Образованиелипопероксильныхрадикаловвреакциях,катализируемых комплексом Цит-КЛ4.3.2.1 Ферментативная активность комплекса Цит-КЛ, находящегося вводно-солевых растворахОкислениелипидов в митохондриальной мембране опосредованореакциями с участием липидных радикалов L• и LOO•, которые образуютсякомплексом ЦитС с анионными липидами, в основном – с митохондриальнымкардиолипином.