Диссертация (Структура и пероксидазная функция комплекса цитохрома c с кардиолипином в водной среде и в неполярном окружении), страница 11

19. Изменение поглощения связи >Fe3+∙∙∙S(Met80) в цитохроме c в присутствииметанола.(А) – Спектр поглощения водного раствора ЦитС.(Б) – Поглощение 200 мкМ растворов ЦитС при 699 нм (А699) как функция отобъемной доли метанола в растворе.На Рис. 19 Б показана зависимость поглощения при 699 нм в воднометанольном растворе ЦитС от объемной доли метанола в растворе.Поглощение при 699 нм было рассчитано, как показано на Рис. 19 А. Эта длинаволны соответствует максимуму поглощения координационной железосернойсвязи между гемовым железом и серой метионина Met80. Исчезновениепоглощения интерпретируется как разрыв данной координационной связи.В то же время, объем белковой глобулы увеличивается в 50% воднометанольномрастворе,начтоуказываетпоявлениефлуоресценциитриптофановых (Рис.

20 А) и тирозиновых (Рис. 20 Б) остатков. Это, как ужеговорилось выше Важно отметить, что в данном случае максимум65флуоресценции находится не при 330 нм (как в растворах большинстватриптофан-содержащих белков и в растворе Цит-КЛ в гексане, Рис. 18 А), а вболее длинноволновой области, что характерно для триптофана в водномИнтенсивность флуоресценции, о.еИнтенсивность флуоресценции, о.еокружении [50, 169].0,9A0,80,720,60,50,40,310,20,103053253453653853,53Б52,5423211,510,50285305325345365385405Длина волны, нмРис.

20. Спектры флуоресценции водно-метанольных растворов ЦитС.(А) – 10 мкМ водный раствор ЦитС (1) и 10 мкМ водно-метанольный (объемная доляметанола 50%) раствор ЦитС (2). Длина волны возбуждающего света – 289 нм.Максимум при 350 нм (2) соответствует флуоресценции триптофановых остатков.(Б) - 10 мкМ водно-метанольные растворы ЦитС с различной объемной долей (%)метанола: (1) 0%, (2) 20%, (3) 30%, (4) 40%, (5) 50%.Длина волны возбуждающего света – 268 нм. Максимум при 307 нм соответствуетфлуоресценции тирозиновых остатков.4.2.2.3 Обратимость конформационного перехода, вызванного метаноломИз спектров на Рис.

21 видно, что 50% метанол подавляет поглощениецитохрома c в пике 699 нм, однако при 5-кратном разбавлении раствора водойспектр поглощения этого раствора практически совпадает с кривой для 10 мкМраствора цитохрома c без метанола.66Поглощение, А0,020,0180,0160,0140,0120,010,0080,0060,0040,002010 мкМ ЦитС50 мкМ ЦитС10 мкМ ЦитС в 10 %метаноле50 мкМ ЦитС в 50%метаноле650670690710730750Длина волны, нмРис. 21. Пики поглощения железосерных связей в ЦитС, указывающие наобратимость действия метанола на ЦитС.С помощью MS Excel мы провели статистическую обработку числовыхданных и вычислили, что после разбавления пробы с 50% метанолом в 5 раз,судяповосстановлениюинтенсивностипоглощенияпри699нм,восстановилась на (91,67±1,83) % n=5; p=0,95.4.2.3 Общее заключение по разделуТаким образом нами была уточнена и стандартизована процедураприготовления раствора Цит-КЛ в неполярной среде и проведен анализ свойствЦит-КЛвэтойсредеспомощьюДСР,спектрофлуориметриииспектрофотометрии.

Было показано, что раствор комплекса в неполярной средесодержит три популяции наночастиц со средними диаметрами 4,7 ± 0,7, 7,8 ±1,0 и 12,1 ± 1,4 нм. Первый тип частиц может быть отдельными молекуламиЦитС с измененной конформацией (4,7±0,7 нм), тогда как два других типачастиц представляют собой молекулами ЦитС, покрытые липидным монослоем(Цит-КЛ) различной толщины в соответствии с различным соотношениемлипид:белок в этих частицах. Конформация ЦитС в растворе Цит-КЛ внеполярной среде изменена, о чем свидетельствуют не только увеличениедиаметра глобулы цитохрома, но и появление тирозиновой и триптофановой67флуоресценции (излучения при 315 и 330 нм, соответственно), а такжеотсутствие поглощения >Fe∙∙∙S(Met80) связей при 699 нм.4.3 Механизм реакций образования липидных радикалов комплексомЦит-КЛ4.3.1 Метод кинетической активированной хемилюминесценции дляизученияреакцийобразованиялипопероксильныхрадикаловкомплексом Цит-КЛ4.3.1.1 Необходимость исследования возможности окисления кумаринов –активаторовхемилюминесценциивпероксидазныхреакциях,катализируемых Цит-КЛПероксидазная функция цитохрома с, связанного с кардиолипином,предполагает, что в ходе реакции образуются свободные радикалы как белка,так и липидов (См.

схемы работы пероксидаз на Рис. 35). Однако изучениереакций с участием свободных радикалов практически невозможно обычнымибиохимическими методами из-за крайней химической активности радикалов,которые поэтому не удается ни изолировать, ни разделить, ни определить ихсвойства. Одним из основных методов обнаружения свободных радикаловслужит измерение хемилюминесценции, сопровождающей взаимодействиедвух частиц с неспаренными электронами с образованием молекулы продуктав электронно-возбужденном состоянии. При цепном окислении липидовмолекулярнымкислородомпромежуточныепродуктыреакции–липопероксильные радикалы LOO• взаимодействуют друг с другом в реакции,сопровождающейся образованием возбужденных карбонилов:LOO• + LOO• → LOH + L=O*,С последующим испусканием кванта хемилюминесценцииL=O* → L=O + фотонМежду концентрацией радикалов LOO• и скоростью реакции цепногоокисления в каждый момент времени имеется прямая пропорциональность, так68же, как и между квадратом концентрации радикалов и интенсивностьюхемилюминесценции.

Кривые хемилюминесценции несут в себе информациюо скорости протекания всех реакций, связанных с образованием липидныхрадикалов. Поэтому математическое моделирование кинетики реакций всистеме с использованием известных начальных концентраций участниковреакции и гипотетических констант скоростей всех реакций позволяет,подбирая константы реакций, добиться удовлетворительного совпадениятеоретических и экспериментальных кривых хемилюминесценции приварьировании условий опыта, т.е. при разных исходных концентрацияхучастников реакций. Этот подход, позднее названный методом кинетическойхемилюминесценции, позволил изучить механизм реакций цепного окислениялипидов в присутствии ионов железа в модельных фосфолипидных мембранахи мембранах митохондрий [14]. Но, насколько нам известно, он никогда неприменялся для изучения реакций ферментативной пероксидации липидов, втом числе при изучении пероксидазной функции комплекса Цит-КЛ.Недостаток метода регистрации собственной хемилюминесценции прилипопероксидации – крайне низкая интенсивность свечения, котораяопределяется как низким выходом образования возбужденных молекул, так инизким выходом самой люминесценции при переходе молекулы продукта извозбужденного состояния в основное.

Решение этой проблемы заключается вприменении активаторов хемилюминесценции двух типов: химических ифизических. Первые вступают в реакции с исследуемыми радикалами, образуяв конечном счете молекулы продуктов своих превращений в электронновозбужденнойсостоянии.Классическимпримеромслужитлюминол,усиливающий свечение при железо-зависимом перекисном окислении липидовв несколько десятков раз [25]. Механизм его действия рассмотрен в обзоре [18].Примером физического активатора служит изохинолизиновый кумарин С-525,усиливающийхемилюминесценциюприжелезо-зависимомперекисномокислении липидов более, чем в тысячу раз. При этом кривые кинетикихемилюминесценции совершенно не изменялись по форме, из чего был сделан69вывод, что С-525 не вступает в химическое взаимодействие ни с участниками,ни с продуктами реакции, а усиление свечения связано с переносом энергиивозбужденного состояния с продукта реакции радикалов, возбужденноймолекулы карбонила L=O*, на акцептор энергии A, кумарин С-525, собразованием возбужденной молекулы последнего A*.

Поскольку квантовыйвыход излучательного перехода A* → A + фотон на 3-4 порядка выше, чем этавеличинаприпереходеL=O*→L=O+фотон,тоинтенсивностьхемилюминесценции тоже увеличивается во столько же раз, при отсутствииизменений в протекании химических реакций.Другиекумарины,аналогитакжеC-525,активировалихемилюминесценцию, в том числе и катализируемую липидными комплексамицитохрома c. Однако являются ли они химическими или физическимиактиваторамихемилюминесценции,илидажепростосубстратамисвободнорадикального окисления присутствии пероксида водорода, липидныхпероксидов или просто молекулярного кислорода - все это не было предметомсерьезных исследований и то, что эти активаторы являются физическими,принималось на веру, по аналогии с кумарином C-525.4.3.1.2 Отсутствие непосредственного окисления кумаринов цитохромом c иего комплексом с кардиолипиномГипотетически возможны показанные ниже реакции в системе ЦитС +ТОКЛ + кумарин:ЦитС + кумарин + O2→ PC + PAЦитС+ ТОКЛ → Цит-КЛЦит-КЛ + кумарин + O2→ PC + PAЧтобывыяснить,действительности,протекаютнамибылилиперваяпроведеныисследования в системах, содержащих:70итретьяреакциивспектрофотометрическиеА)10 мкМ ЦитС,Б) комплекс 10 мкМ ЦитС / 300 мкМ ТОКЛ иВ) 25 мкМ кумарин C-334На Рис.

22 видно, что спектр поглощения смеси ЦитС с C-314 (кривая А3)представляет собой сумму спектров поглощения ЦитС (кривая А1) и C-314(кривая А2), причем спекты поглощения смеси во времени не из менялись(показанодинизподобныхспекров).Этоговоритоботсутствиивзаимодействия между этими соединениями. Точно так же, спектр поглощениясмеси ЦитС с C-314 и ТОКЛ (кривая Б3) представляет собой сумму спектровпоглощения ЦитС + ТОКЛ (кривая А1) и C-314 (кривая А2), причем спектры иэтой смеси также не изменялись во времени.Таким образом, кумарин С-314 не вступает во взаимодействие ни сосвободным цитохромом c, ни с комплексом Цит-КЛ.