Диссертация (Структура и пероксидазная функция комплекса цитохрома c с кардиолипином в водной среде и в неполярном окружении), страница 7

Стоит указать на существенноеснижение пероксидазной активности комплекса в присутствии оксида азота (II)[33].Теперь остановимся непосредственно на механизмах описываемойпероксидазной реакции. На Рис. 11 приведена схема реакций пероксидазмлекопитающих. После взаимодействия фермента с Н2О2 (реакция 1)образуется так называемый Compound 1 – это соединение со степеньюокисления на 2 большей, чем та, что была у исходного фермента (то естьисходный фермент с двумя окисленными эквивалентами): соединение, вкотором есть два «дополнительных» неспаренных электрона, либо радикалпорфирина и четырехвалентное гемовое железо Fe4+, либо Fe4+ и радикаламинокислоты [72].

В статье [139] подробно описаны эти две альтернативныеконцепции для пероксидазы хрена. Compound 1 может реагировать сгалогенидами или тиоционатом, восстанавливаясь до формы исходнойпероксидазы, в которой железо находится в трёхвалентной форме (Рис. 11,реакция 2). Однако в других случаях Compound 1 берёт себе лишь одинэлектрон от субстрата окисления, восстанавливаясь до Compound 2,содержащего Fe4+, но не содержащего радикала (Рис. 11, реакция 3).

Compound2 может вернуться к состоянию с исходного фермента (с трёхвалентнымжелезом) путём реакции 4, по которой он приобретает ещё один электрон [72].38Рис. 11. Общая схема реакций пероксидаз млекопитающих [72].2.3.1 Комплекс Цит-КЛ как апоптогенНаносфераЦит-КЛ–этоферментныйкомплекс,способныйкатализировать реакции окисления липидов внутри клетки.

Комплекс ЦитС санионными липидами, в том числе и с КЛ во внутренней и внешней мембранемитохондрий [44, 45, 89, 92, 94, 96, 164] и фосфатидилсерином вцитоплазматической мембране [68, 93, 95, 162], катализирует перекисноеокисление липидов, что приводит к повышению проницаемости митохондрий,выходу ЦитС в цитозоль и инициации апоптоза, а также инициируетэкстернализацию фосфатидилсерина на поверхности клетки, который являетсядля фагоцитов сигналом «съешь меня». Все эти процессы происходят и придействии Цит-КЛ на раковые клетки, как устойчивые, так и чувствительные клекарственной терапии [179].392.4 Активированнаяхемилюминесценциякакметодизученияобразования свободных радикалов при ЛПО2.4.1 Химические и физические активаторы ХЛХемилюминесценция (ХЛ) может сопровождать многие биохимическиереакции, в которых образуются свободные радикалы, такие как супероксидныйанион радикал (O2●–), гидроксил (HO●) и диоксильные радикалы ненасыщенныхжирных кислот (LОО●) [29, 180] Усилить ХЛ можно при помощи химическихактиваторов или хемилюминесцентных зондов (наиболее часто используютсялюминолилюцигенин)–веществ,непосредственнохимическивзаимодействующих с компонентами исследуемой системы, и физическихактиваторовхемилюминесценциилюминофоров,–перехватывающихэлектронно-возбуждённые состояния продуктов хемилюминесцентной реакциибез химического взаимодействия с компонентами системы.

Квантовый выходсвечения в присутствии этих веществ на несколько порядков величины выше,чем выше, чем в случае собственного (неактивированного) свечения,сопровождающего взаимодействие жирнокислотных пероксил-радикалов [21,29].2.4.2 Химические активаторыНаиболее распространённый химический активатор ХЛ – это люминол, ониспользовался в огромном количестве научных исследований [20, 28, 86, 114,124, 143, 189, 190], реже применяется изолюминол [10], часто для обнаруженияспецифических радикалов используют другие различные активаторы, кпримеру, люциферин-люциферазную систему [29].Принципиальный недостаток химических активаторов — это то, что онивступают в химическое взаимодействие с компонентами изучаемой системы итем самым в принципе нарушают течение процесса, который изучается [123].

Вэтом отношении физические активаторы имеют большое преимущество.402.4.3 Физические активаторыФизические активаторы ХЛ обеспечивают повышение квантового выходаХЛ за счёт перехвата электронно-возбуждённых состояний продуктов реакциибез химического взаимодействия с ними [147, 167, 180].2.4.3.1 Комплексы редкоземельных элементовПоскольку молекулы возбужденного карбонила, образующиеся придиспропорционированиилипидныхпероксил-радикалов,находятсявтриплетном возбужденном состоянии, то теоретически наиболее вероятнымакцептором энергии электронного возбуждения в реакции переноса энергиидолжны служить люминофоры с высокой вероятностью триплет-синглетныхпереходов, какими служат комплексы редкоземельных элементов и красители,применяемые для изготовления лазеров.

В 1980 году В. С. Шаров и сотрудникипоказали,чтокомплекслантанастетрациклиномактивируетхемилюминесценцию при цепном окислении липидов [37]. В статье [148]сообщается, что ионы Tb3+ могут быть использованы в качестве физическихактиваторов ХЛ для изучения процессов перекисного окисления липидов.Однако в биологических системах этот активатор оказался непригодным, т.к.ионы лантаноидов очень токсичны и, главное, связывали трехвалентныеанионы и усиление хемилюминесценции пропадало [37]. Более перспективнымоказался лазерный краситель – изохинолизиновый кумарин C-525 [180].2.4.4 Изохинолизиновые кумариныКумарины (Рис. 12) – это обширная группа органических соединений,представляющих собой ненасыщенные ароматические лактоны, в основекоторых лежит лактон цис-орто-оксикоричной кислоты — 5,6-бензо-α-пирон(кумарин).

Многие из этих веществ используются в качестве лазерныхкрасителей, в том числе и кумарин C-525 [146].41Рис. 12. Кумарин – базовое вещество группы кумаринов, в которой к этомусоединению присоединяются различные заместители и/или циклические группы.В исследованиях, проводившихся в 1995 году, было изучено влияниеразличных активаторов на интенсивность хемилюминесценции при реакцииFe2+-индуцированногоперекисногоокисленияфосфолипидовлипосом,полученных из яичного желтка. Наибольшая степень усиления ХЛ быладостигнутаскумариномС-525(2,3,5,6-1H,4H-тетрагидро-9-(2'-бензимидазолил)-хинолизин-(9,9a, 1-GH)), который увеличивал интенсивностьвспышки ХЛ с коэффициентом более 2000 при концентрации 4 мкМ без какоголибо влияния на кинетику ХЛ [180].

Механизм этого усиления ХЛ – это, повидимому, перенос энергии от молекулы кетона в электронно-возбужденномсостоянии (первичного продукта рекомбинации пероксил-радикалов) нафлуоресцентный уровень кумарина С-525 [147]. Однако стоит заметить, чтокумарин С-525 за счёт наличия в своей структуре пуриновой группировки вопределенныхусловияхпроявляетантиоксидантныесвойства,т.е.взаимодействует со свободными радикалами [88].Кумарин C-525 использовался в большинстве предыдущих исследований,близких к нашей теме. Это уже описанные выше [26, 147, 180], а также работа[165], в которой изучались механизмы антиоксидантной активности аскорбата,токоферола, рутина и β-каротина по подавлению Fe2+-индуцированнойлипопероксидазной реакции, которая оценивалась по ХЛ, активатором которойбыл кумарин C-525. При изучении окисления липопротеинов низкой плотностив среде, содержащей Fe2, наблюдалось увеличение амплитуды быстройвспышки хемилюминесценции в присутствии С-525 [167].

В работе [15]42методоминдуцированнойкумариномC-525ХЛ,изучалосьсвободнорадикальное окисление кардиолипина, находящегося в комплексе сцитохромом c.В качестве механизма действия кумарина назван перенос энергии извозбуждённых триплетных карбонилов L=O*, образующихся в реакциидиспропорционирования липопероксильных радикалов LOO•, которые, в своюочередь, образуются и исчезают в реакции липидной пероксидации:Липидная пероксидация → LOO• → L=O* → L=O + photonКвантовый выход эмиссии фотона очень мал, порядка 10−4. Поэтомусвечение получило название «сверхслабого». В присутствии физическогоактиватора С-525 происходит перенос энергии электронного возбуждения наэто соединениеP* + C-525 → P +C-525*С последующей эмиссией кванта люминесценции кумарина, которыйимеет порядок нескольких десятых единицыC-525* → C-525 + photonВрезультате,.интенсивностьхемилюминесценциивозрастает,взависимости от концентрации активатора, на три порядка величины и более[180].По-видимому, люминесценция кумарина связана с первоначальнымтриплет-триплетным переносом энергии от карбонила на краситель, споследующей эмиссией фотона.

Электронные переходы и люминесценциякумаринов и из производных исследовались в работе [41].Все эти данные говорят о том, что кумарины являются физическими, а нехимическими активаторами ХЛ. Однако оказалось, что кумарин C-525, хорошозарекомендовавший себя при изучении реакций перекисного окислениялипидов биологических мембран, катализируемых ионами железа, разрушаетсяв системе пероксидаза хрена/ H2O2 [146]. Этот результат наталкивает на мысль,что в системе, где пероксидазой служит комплекс цитохрома c с43кардиолипином [15, 20, 35, 47, 88, 92, 93, 96, 120] и есть пероксид водорода, C525 может быть субстратом реакции и расходоваться. Это побудило нас изучитьболее детально, можно ли использовать С-525 и другие кумариновыеактиваторы ХЛ, такие как С-314 и С-334, в опытах по изучению пероксидазнойфункциикомплексаЦит-КЛметодомхемилюминесценции.44активированнойкинетической3МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ3.1 Реагенты• КH2PO4, 20 мМ буферный раствор (рН 7,4);• пероксид водорода (Sigma-Aldrich, США);• кумарин С-314 (Sigma-Aldrich, США);• кумарин С-334 (Sigma-Aldrich, США);• кумарин С-525 (Sigma-Aldrich, США);• цитохром с (Sigma-Aldrich, США);• кардиолипин из сердца быка (Avanti Polar Lipids, США);• 1,1’,2,2’-тетраолеилкардиолипин (Avanti Polar Lipids, США);• пероксидаза из корней хрена (активность 112 ед/мг, М=44173,9),• люминол (5-амино-1,2,3,4-тетрагидро-1,4-фталазиндион, гидразид3-аминофталевой кислоты, М=177,11);• хлороформ квалификации не ниже х.ч.