Диссертация (1174191), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Мы использовалиследующие показатели преломления компонентов смеси при длине волны 633нм: вода – 1.3317 [79], метанол – 1.326 [67], хлороформ – 1.441 [102].Показательпреломлениядляводно-метанольныхметанольной среды рассчитывали по уравнению:51ихлороформ-2 2 − 12 − 1 1 2 − 1= +2 + 2 1 2 + 2 1 2 2 + 2 2Где ϕi – объемная доля компонента, n – показатель преломления смеси, а ni– показатель преломления компонента смеси [131].Показатели преломления двухкомпонентных сред, использовавшихся внастоящей работе, составили: вода-метанол (4:1) – 1,3306, вода-метанол (1:1) –1,3288, хлороформ-метанол (86:14 – согласно работе [71]) – 1,4256.Использовали следующие величины показателей преломления частиц: дляцитохрома c - 1,34 [112], комплекса Цит-ТОКЛ – 1,46 (показатель преломлениялипидного бислоя [121]). Поглощением ЦитС и кардиолипина можнопренебречь, так как в нашем случае было установлено, что поглощение этихвеществ при длине волны 633 нм не влияет на получаемые величины размеровчастиц.Использовалисьследующиевеличиныдинамическойвязкостирастворителей, полученные из литературных данных: вода – 0,89 мПа*сек[106], вода-метанол (4:1) – 1,23 мПа*сек, вода-метанол (1:1) – 1,61 [187].Для хлороформенно-метанольной (86:14 v/v) смеси использовалосьзначениединамическойвязкости,равное0,696мПа*сек.Изменениетемпературы от 303К до 298К соответствует изменению вязкости от 0,6315 [62]до 0,663 мПа*сек [91].
То есть, понижение температуры на 5 градусов приводитк повышению вязкости на 5%. Таким образом, экстраполируя, для 293К мыполучаем значение вязкости, равное 0,696 мПа*сек.3.5 Хемилюминесцентный анализ образования липидных радикаловкомплексом Цит-КЛ3.5.1 Окислениелипидов,катализируемоекомплексомЦит-КЛ,помещенным в неполярное окружение.Хемилюминесценцию измеряли с использованием люминометра Lum5773 (ИнтерОптика-С, Россия), работающего под управлением программногообеспечения PowerGraph (версия 3.3, разработчик Измайлов Д.Ю.). Квази52липоксигеназную активность комплекса Цит-КЛ измеряли следующимобразом. Фоновая хемилюминесценция 21 мкл метанольного раствора 3,6 мМБКЛ (конечная концентрация 150 мкМ), помещенного в стеклянную кювету,была зарегистрирована в течение 30 секунд, затем смесь, состоящую из 13 мкл1 мМ C-525 (раствор в метаноле, конечная концентрация 25 мкМ), 35 мклраствора комплекса Цит-КЛ в хлороформ-метанольной фазе (полученного, какописано ниже), и 426 мкл метанола, вводили шприцем по ходу непрерывногоизмеренияхемилюминесценции.Кинетикухемилюминесценции,сопровождающие квази-липоксигеназные реакции регистрировали в течение 15мин.
Для регистрации кинетики липопероксидазных реакций смесь реагентовиз первой кюветы вводили шприцем в 5 мкл раствора 9 мМ перекиси водорода(конечная концентрация 90 мкМ), находящегося во второй кювете принепрерывном измерении хемилюминесценции.3.5.2 Окисление липидов в мембранах митохондрий, катализируемоекомплексом Цит-КЛВ пустую кювету для ХЛ добавляли 500 мкл смеси, состоящей из 450 мклсуспензии митохондрий, выделенных по описанной выше методике, и 50 мклметанольного 500 мкМ раствора кумарина С-334 или метанола (негативныйконтроль на кумарин) и начинали регистрацию фоновой ХЛ. Затем в кюветудобавляли смесь, состоящую из 50 мкл раствора 2мМ азида натрия, 50 мкм 450мкл 50 мкМ раствора ЦитС, полученного разбавлением 1 мМ раствора ЦитС вбуферном растворе выделения, или 450 мкл буферного раствора выделения(негативный контроль на ЦитС), и 50 мкл метанольного 15 мМ раствора ТОКЛили 50 мкл метанола (негативный контроль на ТОКЛ), и продолжалирегистрацию ХЛ.
Затем в кювету для ХЛ добавляли необходимое количество 5мМперекисиводородаирегистрировалилипопероксидазные реакции.53ХЛ,сопровождающуюСтатистическая обработка данныхПри определении размеров частиц методом ДСР результаты измеренийобрабатывались статистически и определялись средний размер частиц ±стандартное отклонение. Эти данные, полученные с помощью ПО Zetasizer,приведены на рисунках и в тексте.Прирассмотрениирезультатовизмерениякинетикиразрушениякумариновых активаторов ХЛ и ЦитС с помощью метода спектрофотометриина рисунках приведены результаты типичного эксперимента.
Степеньразрушения этих соединений за 8 минут представлена в виде среднего значения± ошибка среднего, полученного в результате 5 независимых измерений.544РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ4.1 Уточнение протоколов приготовления комплекса Цит-КЛВ нашей работе методика приготовления комплекса Цит-КЛ вгидрофобной среде была уточнена, для чего мы изменяли концентрациюметанола и последовательность смешивания реагентов. В результате былавыработана описанная ниже процедура.Смешивали 260 мкМ водно-метанольный (объемное соотношениевода:метанол составляло 4:1) раствор ЦитС с 13,5 мМ с метанольным растворомТОКЛ,чтобыполучитьводно-метанольный(объемноесоотношениевода:метанол составляло 1:1) раствор комплекса Цит-КЛ с мольнымсоотношением липид:белок, равным 30:1.
При таком соотношении липид:белокКЛ находится в избытке, который обеспечивает возможность экстракции ЦитКЛ в хлороформенно-метанольный раствор. Затем, к водно-метанольномураствору комплекса Цит-КЛ добавляли равный объем хлороформа – былаполучена смесь, в которой отношение объемов хлороформ:вода:метанолсоставляло 2:1:1. Данную смесь подвергали интенсивному перемешиванию илицентрифугированию для разделения фаз. После разделения фаз нижнюю(хлороформенно-метанольную) окрашенную в розоватый цвет фракцию,содержащую экстрагированный комплекс Цит-КЛ, отбирали пипеткой Пастерадлядальнейшегоанализаилидлявыпариваниярастворителяиперерастворения.Хлороформенно-метанольная смесь должна экстрагировать все липиды[71].
Таким образом, мы можем предположить, что в верхней (воднометанольной) фазе после экстракции не содержался комплекс Цит-КЛ. Однаконельзя не учитывать тот факт, что в процессе экстракции между фазамиобразовывался осадок, который, судя во всему, содержал приблизительно 73%отисходногоколичестваЦитС.Внижнейфазе,исходяизспектрофотометрических данных, находилось 27% от исходного количестваЦитС. Так как весь кардиолипин должен был оказаться в хлороформенно55метанольной фазе, можно предположить, что соотношение липид:белок вхлороформенно-метанольной фазе составляло приблизительно 60:1.Для спектрофотометрического и спектрофлуориметрического анализаготовили раствор комплекса Цит-КЛ в неполярной среде таким образом, чтобысоотношение липид:белок в исходной пробе составило 40:1.Дляхемилюминесцентногоанализаиспользовалсяболееконцентрированный раствор ЦитС, чтобы мольное соотношение липид:белок висходной пробе составило 2,37:1.
Это позволяло достигнуть лучшейэффективности экстракции комплекса Цит-КЛ в хлороформ.4.2 Строение нанокомплекса Цит-КЛ в гидрофобном окруженииВ этом разделе будут рассмотрены данные, полученные с помощью методаДСР(расшифровать),методаспектрофотомериииметодаспектрофлуориметрии. Мы изучали раствор комплекса Цит-КЛ в неполярномсреде и получили данные, позволяющие судить о таких структурных свойствахкомплекса, как конформация и размер глобулы ЦитС, а также соотношениелипид:белок в комплексе Цит-КЛ, растворенном в неполярной среде, т.е.
вусловиях, моделирующих условия липидного бислоя биологических мембран.4.2.1 Размеры комплекса Цит-КЛДля измерения размеров наносфер Цит-КЛ в неполярном окружении мыиспользовали метод динамического светорассеяния (ДСР). Вначале былиизмереныразмерычастицкардиолипинавводно-метанольнойивхлороформной фракции, а затем – размеры частиц цитохрома c в водномрастворе и комплекса Цит-КЛ в хлороформной фракции.4.2.1.1 Кардиолипин в водном растворе в гидрофобной фазеПоскольку при приготовлении комплекса Цит-КЛ в гидрофобную фазупереходит фосфолипид КЛ, то мы провели исследование, в котором проверили,может ли КЛ, перешедший в гидрофобную фазу, образовывать агрегатынаблюдаемых нами ранее размеров.
С этой целью был измерен размер частиц в56следующих системах: а) в смеси водного раствора ЦитС и метанольногораствора ТОКЛ (Рис. 14, красная кривая) б) в метанольном растворе ТОКЛ (Рис.14, синяя кривая), в) в хлороформенно-метанольном растворе ТОКЛ,приготовленном по аналогии с хлороформенно-метанольным раствором ЦитКЛ, (Рис. 14, черная кривая).Количество частиц, %0,70,7±0,1нм72±12нм71,383±10 нм83,7ЛипосомыТОКЛ + ЦитСЛипосомыТОКЛДиаметр частиц, нмРис.
14. Распределение размеров частиц в хлороформной и водно-метанольной фазах,образующихся при переводе комплекса Цит-КЛ в гидрофобный растворитель.Слева - молекулы ТОКЛ в хлороформной фазе в опыте, где в исходном растворе былтолько ТОКЛ без цитохрома с.Справа – частицы, оставшиеся в водно-метанольной фазе в опытах, где в исходномрастворе был один ТОКЛ (красная кривая) или смесь ТОКЛ и ЦитС в молярномсоотношении 30:1 (синяя кривая). Объемная доля метанола в водно-метанольнойсмеси была равна 50%объемная доля метанола 50%. Исходные концентрации ЦитС –162,5 мкМ, ТОКЛ – 6,75 мМ.
Цифры у кривых – средние размеры частиц в нм,рассчитанные программой прибора.В хлороформной фракции ТОКЛ были обнаружены только частицыдиаметром 0,7±0,1 нм, который можно отнести к индивидуальным молекуламТОКЛ (Рис. 14, черная кривая). Отсутствие частиц других размеров исключаетвозможность того, что КЛ, помещенный в хлороформную фазу, мог обеспечитьпоявление частиц тех размеров, которые наблюдались в хлороформ57метанольном растворе Цит-КЛ.
В 50% метанольном растворе ТОКЛ былиобнаружены частицы диаметром 83±10 нм, которые вероятно представляютсобой однослойне липосомы очень небольшого диаметра (Рис. 14, синяякривая). В аналогичной пробе с добавлением ЦитС (Рис. 14, красная кривая),размер частиц оставался примерно таким же – с диаметром 72±12 нм.К сожалению, в связи с особенностями метода (интенсивность рассеянногосвета зависит от шестой степени диаметра рассеивающих частиц), мы не можемобнаружить в водно-метанольной фракции частицы Цит-КЛ, в количествах,соизмеримых с количеством мембранно-связанного цитохрома c. С другойстороны, само по себе знание размера липосом, не дает возможности отличитьлипосому, состоящую из одного кардиолипина от везикулы, покрытой слоеммолекул цитохрома с.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
