Диссертация (1174191), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Взаимодействие двух радикалов LOO• сопровождается79хемилюминесценцией [170], которая может быть зарегистрирована вприсутствии физического активатора хемилюминесценции - кумарина С-525[180] и, таким образом, может использоваться для оценки ферментативнойактивности комплекса Цит-КЛ.Липопероксильные радикалы (LOO•) могут образовываться в двух типахреакций: 1) разложение предсуществующих гидропероксидов (LOOH), иликвази-липоксигеназных реакциях и 2) перекисном окислении липидов вприсутствии окислителей (например, H2O2), или липопероксидазных реакциях.Раствор комплекса Цит-КЛ в водной среде проявляет каталитическуюактивностькакпоотношениюкквази-липоксигеназным,такилипопероксидазным реакциям (Рис.
30).КвазилипоксигеназнаяреакцияИнтенсивность ХЛ, 103 имп/с2,5Липопероксидазная реакция+ БКЛL•L•2PxPx3H2OC2LOHC21LНLOOH1LНC1C121,52L•L•LНLНЦитС-БКЛ +H2O2ЦитС-БКЛ1H2O230,5+ H2O2ЦитС00246810Время, минРис. 30. Липоксигеназная и липопероксидазная активность комплекса Цит-КЛ.Интенсивность хемилюминесценции (IХЛ) отражает величину концентрациилипопероксильных радикалов (LOO•) в каждый данный момент времени. Перваявспышка свечения (+BCL) связана с реакцией разложения предсуществовавших всистеме гидропероксидов липидов (LOOH).
Вторая вспышка связана с образованиемрадикалов LOO• в пероксидазной реакции (Цит-БКЛ + H2O2), которая начинаетсяпри добавлении в систему H2O2. Цит-БКЛ: 25 мкМ C-334, 10 мкМ ЦитС, 600 мкМБКЛ; BCL: 25 мкМ C-334, 600 мкМ БКЛ; ЦитC: 25 мкМ C-334, 10 мкМ ЦитС, H2O2 150 мкМ.80к4.3.2.2 Ферментативная активность комплекса Цит-КЛ, находящегося внеполярном окруженииИнтенсивность ХЛ, 103 имп/с1А0,910,80,70,60,50,40,30,220,100Интенсивность ХЛ, 103 имп/с185Время, мин10151015Б16314121086442005Время, минРис. 31.Активированная кумарином хемилюминесценция, наблюдаемая приокислении липидов в присутствии Цит-КЛ в неполярной среде(А) – Квази-липоксигеназная активность комплекса Цит-КЛ, помещенного вхлороформенно-метанольную среду.Фаза 1 (0-1,2 мин) соответствует БКЛ (1) или метанолу (2), помещенным визмерительную кювету.Фаза 2 (1,2-9 мин) соответствует добавлению хлороформенно-метанольного раствора,содержащего комплекс Цит-КЛ и С-525. Концентрации компонентов смеси в моментзапуска квази-липоксигеназных реакций (1,2 мин): ЦитС – 5мкМ (по данным СФМ),БКЛ - 150 мкМ, C-525 - 25 мкМ.(Б) – Липопероксидазная активность комплекса Цит-КЛ, помещенного вхлороформенно-метанольную среду.Фаза 1 (0-1,2 мин) соответствует H2O2 (3) или метанолу (4), помещенным визмерительную кювету.Фаза 2 (1,2-9 мин) соответствует добавлению раствора из пробы, описанной в (А),после измерения кинетики ХЛ, сопровождающей квази-липоксигеназные реакции.Концентрация H2O2 в момент запуска липопероксидазных реакций - 90 мкМ.81Для анализа хемилюминесценции комплекс Цит-КЛ в хлороформметанольной среде получали в следующим образом.
100 мкл 8,3 мМ раствораТОКЛ в метаноле смешивали с 233 мкл 1,5 мМ водного раствора ЦитС и 157мкл метанола (молярное отношение ТОКЛ: ЦитС составило 2,37: 1, объемноесоотношение вода: метанол составило 10:11). Затем добавляли 490 мклхлороформа и полученную смесь встряхивали и центрифугировали при 1350 gвтечение15мин.Хлороформ-метанольнуюфракцию,содержащуюэкстрагированный комплекс Цит-КЛ, отбирали пипеткой Пастера длядальнейшего анализа.В рамках данного исследования была изучена ферментативная активностьЦит-КЛ, помещенного в неполярную среду (Рис.
31). Натуральный препаратБКЛ, состоящий в основном из тетра-линолеил кардиолипина, который легкоподвергается окислению, в этом исследовании использовался, с одной стороны,в качестве источника предсуществующих гидропероксидов (субстратов квазилипоксигеназных реакций), а с другой – в качестве окисляемого субстрата влипопероксидазных реакциях. На Рис. 31 А отражена кинетика кумаринактивированной ХЛ, сопровождающей квази-липоксигеназные реакции,запускаемые при добавлении раствора Цит-КЛ в хлороформенно-метанольнойсмеси к раствору БКЛ. Добавление Цит-КЛ к метанолу, а не к БКЛ, неприводило к появлению ХЛ (Рис. 31 А, 2), а исключение других компонентовреакционной смеси (ЦитС или кумарина С-525) снижало интенсивность ХЛ дофонового уровня (данные не приведены).После того, как предсуществующие в БКЛ липидные гидропероксидыбыли полностью израсходованы в ходе квази-липоксигеназных реакций, на чтоуказывает снижение интенсивности ХЛ до постоянного уровня, в пробудобавлялся раствор пероксида водорода.
Это приводило к образованию новойпорции липидных радикалов, что сопровождалось увеличением интенсивностиХЛ (Рис. 31 Б, 3). В этих реакциях, липопероксильные радикалы (LOO•)образуются при окислении молекул липидов (LH) пероксидом водорода в82присутствии комплекса Цит-КЛ, который выполняет роль липопероксидазы. Вотсутствии H2O2 не наблюдается характерной кинетики ХЛ, что говорит о том,что не происходят липопероксидазные реакции (Рис. 31 Б, 4).4.3.2.3 Реакции, катализируемые Цит-КЛ в митохондриальных мембранах1,8Полная система1,6Интенсивность ХЛ, 103 имп/с5Добавки:1) С-334 + тени2) ЦитС-ТОКЛ3) NaN34) 10 мкл H2O25) 100 мкл H2O21,41,21,00,80,60,4120,2430,005Без ЦитС0,40,2115103242025202550,005Без ТОКЛ0,21210315450,00510152025Время, минРис.
32. Хемилюминесценция, наблюдаемая при добавлении комплекса Цит-КЛ кмембранам митохондрий. ЦитС – 22,5 мкМ, ТОКЛ – 750 мкМ, С-334 – 25 мкМ, NaN3 –100 мкМ, H2O2 – 45 мкМ (добавка 4) и 500 мкМ (добавка 5).С помощью активированной кумарином С-334 хемилюминесценции намибыло изучено окисление липидов в мембранах изолированных митохондрий,опосредованное действием комплекса Цит-КЛ. Для ингибирования каталаз вреакционную систему добавлялся азид натрия.Мы можем видеть (Рис. 32), что при добавлении 500 мкМ H2O2 происходитвспышка хемилюминесценции, которую можно связать с образованиемлипидных радикалов в ходе пероксидации липидов. Стоит отметить, что83подобный эффект не наблюдался при добавлении 45 мкМ перекиси водорода.Если мы не добавляли цитохром с в реакционную систему, то наблюдалиизменение хемилюминесценции уже при добавлении ТОКЛ к системе:хемилюминесцентный сигнал начинал медленно расти во времени, адобавление 450 мкМ перекиси водорода повышало хемилюминесцентныйсигнал, но не приводило к развитию вспышки, характерной для системы, вкоторую добавляли и цитохром с, и ТОКЛ.
Если же мы не добавляли ТОКЛ вреакционную систему, то практически не наблюдали никакой кинетикихемилюминесценции – лишь добавление 450 мкМ перекиси приводило кнезначительному повышению хемилюминесцентного сигнала, который за 7минут снижался до фонового уровня.4.3.3 Изучение механизма цитотоксического действия комплекса Цит-КЛна раковые клеткиВ исследовании, проведенном нами в кооперации с американскимиколлегами [179], было показано, что комплекс Цит-КЛ может индуцироватьапоптоз, тогда как ЦитС неэффективен при введении в виде свободной формы.Это изменение активности было объяснено появлением пероксидазнойактивности ЦитС при образовании комплекса с ТОКЛ (Сравни [96, 161]).
Оченьважно, что Цит-КЛ успешно вызывал апоптоз как в обычных раковых клетках,так и в резистентных к лекарствам клеточных линиях, что в свою очередьвызывает значительную цитотоксическую эффективность в обоих типахклеток.Была предложена схема участия комплекса Цит-КЛ в реакциях липиднойпероксидации (Рис. 36), согласно которой наночастицы Цит-КЛ проникаютчерез цитоплазматическую мембрану (стадия 2 на рисунке) и наружнуюмембрану митохондрий (стадия 4), внедряются во внутреннюю мембрану(стадия 5) и катализируют там реакции липидной пероксидации (стадия 6), чтои приводит к апоптозу (стадия 7).
Нашей непосредственной экспериментальной84задачей было обосновать ключевые стадии 5 и 6 на этой схеме. Результатынаших экспериментов показали следующее:1) Комплекс Цит-КЛ способен вызывать липидную пероксидациюполиненасыщенных жирных кислот, входящих в состав кардиолипина(в том числе формирующего оболочку комплекса).Результаты этого исследования описаны в разделе 4.3.2 (см. также Рис. 30)и вошли в совместную статью [179].
Эти результаты говорят о том, что Цит-КЛкатализируетобразованиелипидныхрадикаловкакприразложениипредсуществующих липогидропероксидов (квази-липоксигеназная реакция),так и при окислении полиненасыщенных жирнокислотных хвостов природногокардиолипинаподдействиемпероксидаводорода(липопероксидазнаяреакция).2) Антиоксиданты-перехватчикидигидрокверцетинсвободных(таксифолин),радикалов,тормозяттролоксилипопероксидазнуюреакцию в очень низких концентрациях – десятые доли мкМ (Рис. 33,правая часть кривых ХЛ).
В таких концентрациях антиоксиданты налипоксигеназную реакцию практически не действовали (левая частькривых ХЛ).2,5AИнтенсивность ХЛ, 103 имп/сИнтенсивность ХЛ, 103 имп/с21,81,61,41,2Б21,510,80,60,410,50,2000510150Время, мин51015Время, минРис. 33. Влияние антиоксидантов на квази-липоксигеназную (первая часть кривойхемилюминесценции, до 4-й минуты) и липопероксидазную реакцию (вторая частькривой ХЛ, с 4-й до 11-й минуты), катализируемые комплексом Цит-КЛ.А - действие тролокса, Б - действие таксифолина.Реакционная система: Черные кривые: 25 мкМ C-334, 10 мкМ ЦитС, 600 мкМ БКЛ,100 мкМ Н2О. Зеленая кривая: + 0,25 мкМ таксифолин.
Синие кривые: (А) + 0,10 мкМтролокс, (Б) + 0,51 мкМ таксифолин. Красные кривые: (А) + 0,20 мкМ тролокс, (Б) +2,54 мкМ таксифолин.85Ранее на кафедре Общей и медицинской биофизики РНИМУ былопоказано, что перехватчики свободных радикалов, такие как дигидрокверцетин(таксифолин)ирутин,тормозятобразованиелипидныхрадикалов,образующихся при добавлении ЦитС к природному (бычьему) кардиолипину вконцентрациях около 10 и 4 мМ, соответственно [15]. Это соответствует нашимданным об отсутствии действия антиоксидантов на липоксигеназную реакциюЦит-КЛ в концентрациях ниже 0,25 мкМ. Влияние антиоксидантов налипопероксидазную реакцию, катализируемую комплексом Цит-КЛ, ранее неизучалось.Кинетические кривые хемилюминесценции на Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
