Диссертация (1174191), страница 14
Текст из файла (страница 14)
33 показывают, что внашем случае тролокс ведет себя как антиоксидант сильного типа, т.е. егодобавление приводит к появлению латентного периода ХЛ, тогда кактаксифолин является антиоксидантом промежуточной силы, поскольку в егоприсутствии снижалась скорость нарастания ХЛ и отодвигался максимумсвечения (Сравни данные работ [31],[30]).Форма кинетических кривых на рис. 33 близка к наблюдавшейся припероксидазных реакциях пероксидазы хрена, что говорит об одинаковоммеханизме промежуточных реакций в каталитическом цикле [30].3) Будучи добавленным к митохондриям, комплекс Цит-КЛ вызываетпероксидацию липидов в этих органеллах.
Эта часть данногоисследования была выполнена уже после написания статьи [179].Всовокупностинаширезультатыпоказывают,чтомеханизмапоптотического и цитотоксического действия Цит-КЛ на раковые клеткиможет включать в себя катализ липидной пероксидации в мембранахмитохондрий, который приводит к образованию липопероксильных радикаловв квази-липоксигеназной и липопероксидазных реакциях.865ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВКомплекс цитохрома c с кардиолипином играет ключевую роль в развитиимитохондриального пути апоптоза.
Структура комплекса – это вопрос многихэкспериментов и дискуссий. Были предложены две основные структуры:мембранно-связанный цитохром c [49] и наносферы Цит-КЛ [173] (См. Обзорлитературы, Рис. 10).В водных средах наносферы Цит-КЛ имеют тенденцию к агрегации собразованием микрокристаллов определенного соотношения между липидом ибелком и диаметром 11-12 нм [16].До сих пор не было получено данных о свойствах наносфер Цит-КЛ вводных или других растворах в не агрегированном состоянии.5.1 Комплекс Цит-КЛ в разбавленных водных растворах и в неполярнойсреде имеет тот же стехиометрический коэффициент липид:белок, чтои в микрокристаллическом осадкеВ работе, проведенной совместно с сотрудниками кафедр медицинскойбиофизики ФФМ МГУ и аналитической химии Химфака МГУ методамиспектрофотомерии и термолинзовой спектроскопии, в которых мы принималиучастие, были сопоставлены результаты спектрофотометрического титрованияЦитС раствором кардиолипина (ТОКЛ), который показывает соотношениебелок:липид (ТОКЛ:ЦитC) в осадке Цит-КЛ, с результатами аналогичноготитрования разбавленных водных растворов цитохрома с регистрациейобразования Цит-КЛ по снижению термолинзового сигнала КЛ в комплексе посравнению с исходным белком [138].Результаты сравнения данных по соотношению липид:белок в осадке ЦитКЛ и в разбавленных водных растворах при разных pH приведены в Табл.
5.Из этих данных видно, что при всех исследованных рН отношениебелок:липид было одинаковым в микрокристаллах и разбавленных водныхрастворах, несмотря на то, что в слабощелочной (pH 7,4), слабокислой (pH 6,5)и кислой среде (pH<5,5) эти значения в обоих случаях были разными.87Табл. 5. Стехиометрическое отношение ТОКЛ /ЦитС (моль/моль) в комплексах ЦитКЛ при разных рН в микрокристаллическом осадке (фотометрия осадка) и вразбавленном буферном растворе (термолинзовый сигнал).
По данным работы [138].МетодопределениясвободногоpH=7,4pH=6,5pH=5,5pH=4,1pH=3,759±738±513±314±313±4603010ЦитСФотометрияосадкаТермолинзовыйсигнал-Как было показано в наших опытах (см. «Результаты и обсуждение»), врастворе комплекса Цит-КЛ в гидрофобном растворителе соотношениелипид:белок было 60:1, то есть такое же, как и водном растворе и вкристаллическом осадке при pH 7,4. Это говорит о том, что во всех трехизученных системах состав наночастиц Цит-КЛ был одним и тем же, чтопредполагает и одинаковость размеров наносфер в этих трех случаях.
Нашипоследующие опыты подтвердили этот вывод.5.2 Размеры наносфер Цит-КЛ в неполярном растворителе менееоднородны, чем в микрокристаллах, но имеют те же средниевеличиныРанее при изучении МУР в осадке комплекса Цит-КЛ было показано, чтоэтот осадок содержит микрокристаллическую структуру с межплоскостнымирасстояниями 8,0 и 11,1 нм [137, 151, 171, 173]. Это позволило предположить,что комплекс Цит-КЛ, образующийся в клетках, является наносферой88приблизительно тех же размеров, состоящей из молекулы ЦитС, окруженноймонослоем КЛ.БА>16 нмГидрофобнаянаночастица11,2 нм7,8 ±1,0 нм3,6 ±1,0 нм12,1±1,4 нм4,7 ±0,7 нмГидрофобная средаВода3,6 – 4,1 нмЦитС вводнойсреде5,6 нмЦитС вЦит-КЛРис.
34. Схема возможного строения частиц, наблюдаемых при образовании Цит-КЛ внеполярном растворителе (А) и в липидном бислое мембраны митохондрий (Б).А- средние размеры частиц ЦитС и Цит-КЛ, оцененные с помощью метода ДСР.Красным и оранжевым цветом обозначены молекулы ЦитС в нативном и«расплавленном» состояниях, соответственно. Фиолетовым цветом обозначенамолекула частично расплавленного ЦитС, на поверхности которой находятсягидрофобные участки, отсутствующие на поверхности молекулы ЦитС в нативномсостоянии. Голубым цветом обозначены липидные слои молекул КЛ, окружающиемолекулу ЦитС.Б – гипотетическая схема внедрения Цит-КЛ в липидный бислой мембранымитохондрий, предложенная в работе [176], фрагмент рисунка из статьи [122].Диаметр молекулы ЦитС рассчитан исходя из данных, полученных методом МУР приизучении микрокристаллического осадка комплекса Цит-КЛ.
Голубым цветомобозначена полярная поверхность «расплавленной» глобулы ЦитСВ данной работе показано, что раствор комплекса Цит-КЛ в гидрофобномрастворителе содержит две группы частиц - с диаметром 7,8±1,0 и 12,1±1,4 нм.Также в этом растворе обнаруживалась группа частиц с диаметром 4,7±0,75 нми частицы с диаметром более 16 нм (Рис. 34).Важно отметить то, что диаметры двух основных групп частиц,обнаруженных в растворе Цит-КЛ в неполярной среде с помощью метода ДСР(12,1±1,4 и 7,8±1,0 нм) близки к значению 11,2 нм, полученным длямикрокристаллического осадка Цит-КЛ [173], а также к значениям 11,1±1,0 нм89и 8,0±0,7 нм, полученным в более поздней работе также при изучении осадкаЦит-КЛ [151, 171]. Соотношение липид:белок в осадке, оцененное с помощьюметода СФМ в надосадочной жидкости после центрифугирования и отделенияосадка, оказалось постоянным при титровании ЦитС раствором КЛ [173], приэтом, было показано, что это соотношение изменяется в зависимости от pHсреды: 13±4 при pH 3,5-5,7 и 59±7 при pH 7,4 [176].Таким образом, мы можем предположить, что существуют как минимумдва типа частиц Цит-КЛ – размером приблизительно в 11 нм с соотношениемлипид:белок, равным 59 и с размером приблизительно 8 нм с соотношениемлипид:белок, равным 13.
При этом, при различных pH в осадок выпадаютчастицы того или иного типа, хотя в растворенном состоянии частицы разныхтипов могут существовать одновременно.По-видимому,двесамыемногочисленныефракциинаночастиц,наблюдаемые с помощью метода ДСР в нашей работе, различаются по размерукак раз из-за различного количества молекул кардиолипина в липидноммонослое, покрывающем белковые глобулы. Ниже приводятся факты,подтверждающие такое предположение. Легко подсчитать приблизительныйобъем липидного монослоя (VL) в наносфере с диаметром 8 нм или 12 нм, еслирадиус белковой глобулы внутри наносферы составляет 5,6 нм. ОтношениеVL(12) / VL(8) составляет 4,62. Отношение количества липидных молекул (n) вчастицах этих двух типов n(12) / n(8) = 59/13 = 4,54.
Таким образом, мы можемзаключить, что разница в размере двух основных фракций Цит-КЛ (толщиналипидного слоя 2,8 и 1,0 нм для больших и меньших частиц, соответственно)связана с количеством молекул липидов, прикрепленных к поверхности ЦитС.Так как в расчетах мы использовали постоянную величину радиуса белковоймолекулы, то можно также заключить, что различный размер частиц Цит-КЛ несвязан с изменениями в конформации ЦитС.905.3 ВнаносферахЦит-КЛЦитСимеетконформациючастичнорасплавленной глобулыДанные, полученные в нашей работе, показали, что цитохром с внаносферах Цит-КЛ, находящихся в неполярной среде, имеет частичнорасплавленную конформацию (Рис. 18). Более ранние данные по осадкам ЦитКЛ показали, что размер ЦитС внутри наносферы существенно больше, чемразмер ЦитС, растворенного в воде [173].
Это также касается и Цит-КЛ,растворенного в хлороформе (Рис. 15-Рис. 17) и указывает на расплавленноесостояние глобулы ЦитС.В присутствии кардиолипин-содержащих липосом ЦитС приобретаетспособность флуоресцировать в УФ-области спектра за счет остатков тирозинаи триптофана [47 10, 100]. В нашей работе наблюдалась сильная тирозиновая итриптофановая флуоресценция в растворенном в гексане Цит-КЛ (Рис. 18). Вобоих случаях данные указывают на увеличение расстояния между остаткамиTyr и Trp и гемом, акцептором энергии, которое в нативном цитохроме сменьше радиуса Ферстера для этой пары донор-акцептор.
На Рис. 18 показано,что флуоресценция триптофана наблюдается только при возбуждении при 289нм, поскольку тирозин не поглощает при этой длине волны, в то время какмаксимум флуоресценции тирозина при 305 нм преобладает при длине волнывозбуждающего света, равной 265 нм. Отметим, что спектр флуоресценциитриптофана имеет тонкую структуру с максимумами, характерными дляиндольного кольца в гидрофобной среде [109, 168].Кроме того, известно, что разрыв связей >Fe∙∙∙S(Met80) приводит к тому,что ЦитС приобретает ферментативные свойства пероксидазы, что и былоподтверждено при исследовании ферментативных свойств хлороформеннометанольного раствора Цит-КЛ с помощью метода кумарин-активированнойХЛ,вкоторомбылопоказаноналичиеквази-липоксигеназнойилипопероксидазной активности у хлороформенно-метанольного раствора ЦитКЛ (Рис. 32).91В то же время в этом объекте исчезает полоса поглощения около 700 нм,что указывает на разрушение координационной связи между железом гема иатомом серы аминокислотного остатка Met80 [47, 178].
Это также подтверждаетвывод о том, что в наночастицах Цит-КЛ, растворенных в гидрофобной среде,ЦитС имеет расплавленную конформацию с разрушенными >Fe∙∙∙S(Met80)связями.Как уже было отмечено в обзоре литературы, изменение конформацииЦитС при его взаимодействии с КЛ отмечалось многими авторами. Однако досих пор никем не изучалась конформация ЦитС, находящегося внутриинвертированных мицелл КЛ, помещенных в гидрофобное окружение. Схожийобъект, а именно ЦитС внутри инвертированной мицеллы, приготовленный впентане, имел практически такой же спектр ЯМР, как и ЦитС, растворенный вводе [133].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
