Диссертация (1174191), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Очевидно, что в данном случае инвертированная мицелла неоказывала присущего КЛ эффекта на конформацию ЦитС, что может бытьсвязано с тем, что такая мицелла имеет меньшее сродство к ЦитС, чем КЛ.Известно, что структурные свойства липида определяют степень его сродства кЦитС [156].Влитературепредставленыразличныеспособыинтерпретацииконформации мембранно-связанного ЦитС. Мандал и сотрудники показали, чтопри связывании ЦитС с мембраной пероксидазная активность ЦитСповышается (однако, всего в 2 раза по сравнению со свободным ЦитС), приэтом они не наблюдали признаков того, что глобула ЦитС изменяетконформацию или же проникает внутрь мембраны [120]. В работе [47] присоотношениях липид:белок, выше 25, пероксидазная активность ЦитС присвязывании с липосомами, содержащими КЛ, была приблизительно в 30 разболее высокой, чем у свободного ЦитС.
В подобных условиях наблюдалосьзначительноеразвертываниебелка,начтоуказываетувеличениеинтенсивности тирозиновой и триптофановой флуоресценции по сравнению сосвободным ЦитС [47, 99]. Докинг с линолевой кислотой, наиболеераспространенной жирной кислотой в составе КЛ, показал, что атом С11 может92примыкать к тирозину в 67 положении и гему, что соответствует оксигенации,наблюдаемой в исследованиях липидомики [125].
Эти и другие данные (см.[136]) были интерпретированы в рамках предположения о том, что ЦитСсвязывается с наружной поверхностью липидного бислоя, без учетавозможности образования гидрофобной частицы Цит-КЛ, в которой ЦитСнаходится в частично развернутом состоянии [171, 173, 176]. Значительно ранееде Круифф и Куллис в исследованиях взаимодействия ЦитС с липосомами,содержащими КЛ, с помощью методов 31Р-ЯМР и техники замораживанияскалывания показали, что ЦитС специфично способствует образованиюгексагональной структуры, и, возможно, структуры инвертированной мицеллы[64].
Они предполагали, что наносферы, очень похожие на ту, что представленана Рис. 9 в этой работе, могут образовываться при перемещении ЦитС помембране. На самом деле, свободный ЦитС в нативном состоянии не можетпроникать внутрь липидного бислоя, но это становится возможным, когда ЦитСнаходится в комплексе с КЛ, что показано в работах с искусственнымилипидными мембранами [40, 48, 70].5.4 Образование наносфер Цит-КЛ происходит по принципу «все илиничего»Мы сравнили отношение кардиолипина к белку (КЛ:ЦитС) двумяспособами:спектрофотометрическимтитрованием(CAS)испектроскопическим титрованием с термической линзой (TLS).CAS использовали при высокой начальной концентрации ЦитС (0,2 мМ),при которой осаждался комплекс цитохрома c и кардиолипина. Таким образом,мы определяем отношение КЛ:ЦитС в осадке, то есть в микрокристаллах ЦитКЛ.
Измерения TLS проводились при концентрации 1 мкМ и ниже, гдекомплекс нерастворим. В этом случае мы определяем отношение КЛ:ЦитС вводном растворе.Во всех экспериментах по спектрофотометрическому титрованиюкардиолипина с цитохромом с первые точки всегда лежат на прямой, что93означает, что каждая (равная) часть добавленного липида приводит кобразованию того же количество конечного комплекса как в начале, так и вконце титрования. Такая же картина характерна и для экспериментов потермическому линзовому титрованию, хотя сложный водорастворимый принизких концентрациях компонентов.Это означает, что до тех пор, пока в растворе имеются молекулысвободного цитохрома c, молекулы липидов присоединяются к каждоймолекуле цитохрома до тех пор, пока она не будет насыщена, а затем начнетзаполнять следующую «пустую» молекулу белка.
В противном случае на всехкривых титрования первые части липида будут давать меньший выходконечного комплекса, чем последующие. Между тем именно формированиеконечногокомплексаприводиткобразованиюмикрокристалловвэкспериментах с спектрофотометрическим титрованием и дает эффекттепловой линзы.Объяснение этого явления с точки зрения физики очевидно. Перваямолекула кардиолипина, взаимодействующая с молекулой цитохрома,связывается электростатически с высокоаффинным местом связывания липидана поверхности белка [34]. Это обеспечивает большой выигрыш в энергии, ноего можно предотвратить за счет увеличения ионной силы в присутствии АТФи т.
д. Но главным вкладом в энергию, которая при этом выделяется, будетудаление воды из промежутка между четырьмя углеводородными хвостамиодной молекулы кардиолипина и хвостами другой, иными словами – слияниеуглеводородных цепей. Вторая молекула также найдет положительный заряд наповерхности белка, но основной вклад в высвобождаемую энергию являетсяудаление воды из зазора между четырьмя углеводородными хвостами одноймолекулы кардиолипина и хвостами другого другими словами - энергияслияния углеводородных цепей. По этой же причине всем последующиммолекулам кардиолипина энергетически выгоднее присоединиться не ксвободной молекуле цитохрома c, а к той, где уже началось заполнениеповерхности.
Для «эффекта слияния» не имеет значения, происходит ли94добавление молекулы кардиолипина, непосредственно растворенного вокружающей среде, или молекулы, которую необходимо извлечь из липидногобислоя соседней мембраны. Принцип «все или ничего» будет диктоватьнаправление процесса в обоих случаях.5.5 Строение комплекса Цит-КЛ в гидрофобном растворителе и вмикрокристаллах Цит-КЛ совершенно одинаковыВ результате нашего исследования была установлена процедураприготовления раствора Цит-КЛ в неполярной среде для анализа его свойств спомощью достаточно простых, но мощных методов, таких как ДСР,спектрофлуориметрияиспектрофотометрия.Впервыеисследованообразование комплекса Цит-КЛ в неполярной (хлороформенно-метанольной)среде, имитирующей микроокружение липидной мембраны.
Полученныерезультаты хорошо согласуются с результатами анализа кристаллов комплексаметодом МУР. Установлено, что раствор комплекса в неполярной средесодержит три популяции наночастиц со средними диаметрами 4,7 ± 0,7, 7,8 ±1,0 и 12,1 ± 1,4 нм. Эти частицы, вероятно, являются отдельными молекулыЦитС с конформацией частично расплавленной глобулы (4.7±0.7 нм) имолекулами ЦитС, покрытыми липидным слоем (Цит-КЛ) различной толщиныв соответствии с различным соотношением липид:белок в частицах Цит-КЛ(две других фракций). Конформация ЦитС в растворе Цит-КЛ в неполярнойсреде изменена, о чем свидетельствуют: а) увеличение диаметра ЦитС б)появление тирозиновой и триптофановой флуоресценции (излучения при 315 и330 нм, соответственно), и в) отсутствие поглощения >Fe∙∙∙S(Met80) связей при699 нм.955.6 Реакции окисления липидов с образованием свободных радикалов вприсутствии раствора Цит-КЛ идут по механизму пероксидазногоциклаA•PxH2O23АН1Пероксидазный(Px) циклC2H2OC12A•АНПероксидазный циклЛипопероксидазные реакцииPx: Pr♦Fe3+L•PxБез разветвления цепиH2O21↓L• + O2 → LOO•3C1: Pr●♦Fe4+=O12LOO• → L=O* → PhotonЛипоLН2↓H2O С разветвлением цепипероксидазный4+C2: Pr♦Fe =O(LPx) циклL• + O2 → LOO•↓↑C2C1●3+LOO• + LH → LOOH + L• →C2: Pr ♦Feэти две реакции3↓2многократноPx: Pr♦Fe3+LНL•повторяютсяКвази-липоксигеназные реакцииL•Px3LНLOOH1LOOHLOHиндуцированныйLPx цикл (1)C2C12L•LНБез разветвления цепиL• + O2 → LOO•2LOO• → L=O* → ФотонС разветвлением цепиL• + O2 → LOO•LOO• + LH → LOOH + L• →эти две реакциимногократно повторяютсяКвази-липоксигеназные реакции(альтернативный механизм)Без разветвления цепиLO • + LH → LOH + L••LPxLOOH L• + O2 → LOO•2LOO• → L=O* → Photon31LOOHLН•С разветвлением цепиLOиндуцированныйL• + O2 → LOO•LPx цикл (2)LOO• + LH → LOOH + L• →эти две реакцииC2многократно повторяютсяРис.
35. Предполагаемые механизмы пероксидазных и липопероксидазных реакций,катализируемых комплексом Цит-КЛ.Px – пероксидаза; Pr – апо-пероксидаза; Pr• - свободный радикал белка; C1 –соединение 1 (Compound I); C2 – соединение 2; ♦ - порфириновое кольцо гемапероксидазы; AH – второй субстрат пероксидазной реакции; A• - свободный радикалсубстрата; LH – полиненасыщенная жирная кислота; L• – липидный (алкильный)радикал; LOO• – липидный (пероксильный) радикал; L=O* – кетон (продуктдиспропорционирования двух радикалов LOO•), в возбужденном состоянии.
Верхнийряд, слева: Пероксидазный цикл реакций, катализируемых пероксидазой из корнейхрена, впервые изученная Б.Чансом [55-57]. Верхний ряд, справа:липоксипероксидазный цикл реакций, в котором LH выступают в роли второгосубстрата. Нижний ряд, слева: липоксипероксидазный цикл, в котором LOOHвыступают в роли первого субстрата. Нижний ряд, справа: Гипотетическая схема техже квази-липоксигеназных реакций, что и снизу слева, при условии, что Px и LOOHвзаимодействуют по одноэлектронному механизму с образованием радикала LO• ипромежуточного продукта C1. В обоих механизмах квази-липоксигеназных реакций вцикле расходуется две молекулы липида.В отличие от других гемопротеинов, ЦитС, находясь в окисленной форме(содержащей Fe3+), не катализирует окисление органических субстратовгидропероксидами.
При этом, Цит-КЛ, приготовленный по схеме, схожей с той,что использовалась в настоящей работе, при соотношении липид:белок, равном32/1, оказался достаточно сильной пероксидазой [177] и липопероксидазой96Возможные[172].механизмытакихпероксидазныхреакцийпроиллюстрированы на Рис.
35.Циклпероксидазныхреакций,всущности,состоитизтрехпоследовательных реакций [56]:1. Px (пероксидаза) + ROOH ⇄ Соединение I2. Соединение I + AH → Соединение II + A3. Соединение II + AH → Px + A,, где гидропероксид ROOH является первым субстратом, а AH – вторымсубстратомпероксидазныхреакций,приэтомпервичныйпродукт,обозначенный в работе Чанса как «А», в действительности является радикаломA•.В тех случаях, когда вторым субстратом является люминол (LumH),образование радикала Lum• запускает последовательность реакций [175],приводящую к хемилюминесценции [61].Ранее было показано, что в буферном водном растворе наночастиц Цит-КЛпри добавлении в него H2O2 наблюдается образование липопероксильныхрадикалов [172] и что антиоксиданты подавляют липопероксидазную реакцию.Это указывает на то, что липидная пероксидация, катализируемая Цит-КЛ,протекает по тому же механизму, что и классические пероксидазные реакции(Рис. 35, верхний ряд, слева и [72]).В присутствии кислорода первичный продукт липопероксидазной реакцииL• мгновенно взаимодействует с O2, образуя липоперокильный радикал LOO•.Этот радикал представляет большой интерес для клеточной биологиипатологии, так как он инициирует реакции цепного перекисного окислениялипидов [168, 174].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
