Диссертация (1174191), страница 16
Текст из файла (страница 16)
В связи со значительной длиной цепи таких реакций [60] вмитохондриальных мембранах количество образовавшихся гидропероксидовLOOH может быть значительно (вплоть до одного порядка величины) вышеколичества потреблённого H2O2 [149].975.7 Возможно и перспективно применение комплекса Цит-КЛ в качестведействующего противоракового средства нового типаРис. 36. Возможные механизмы проапоптотического и цитотоксического действияЦит-КЛ на раковые клетки [179]. 1 - микрокристаллы Цит-КЛ находятся вравновесии с гидрофобными наносферами комплекса Цит-КЛ. 2 - Комплекс Цит-КЛможет проходить через клеточную мембрану. 3 - Наносферы избавляются от своейлипидной оболочки, а «голый» цитохром c входит в цитозоль. Это событие могло быактивировать каскад опосредованных каспазой реакций, заканчивающихся гибельюклеток, апоптозом.
4 - Более вероятным событием является прохождение Цит-КЛ вмитохондриях и его включение во внутреннюю мембрану митохондрий. 5 -.Гидрофобная наносфера Цит-КЛ диффундирует внутри липидного бислоя и (6)инициирует перекисное окисление липидов повсюду на своем пути. 7 - В этот процессприводит к запуску реакций апоптоза и, в конечном счете, - к гибели клетки. 8 Антиоксиданты блокируют перекисное окисление. 9 - Альтернативно на стадии 2,Цит-КЛ может быть встроен во внешнюю мембрану и катализировать перекисноеокисление липидов. Это приведет к экстернализации фосфатидилсерина, которыйслужит сигналом «съешь меня» для фагоцитов.Чтобыпонятьпричинуэффективногопроапоптогенногоицитотоксического действия на резистентные клетки, стоит сказать несколько98слов о самом механизме резистентности клеток к лекарственному препарату.Один из них рассмотрен работе [135], где было показано, что Bcl-2, которыйможетпредотвратитьвысвобождениеЦитСизмитохондрий,резкоэкспрессируется в клетках A2780-Adr по сравнению с родительскими клеткамиA2780.ИзбыточнаяэкспрессияBcl-2приводиткинактивациипроапоптотических белков BH-123, Bax и Bak, которые ответственны запермеабилизацию наружной мембраны митохондрий (см.
Обзор [76]).Очевидно, что Цит-КЛ, вызывая пероксидацию липидов в мембранахмитохондрий, может вызвать апоптоз раковых клеток в обход этого (и других)способов приобрести резистентность к противораковому средству.С целью объяснить молекулярно-клеточные механизмы проапоптогенногои цитотоксического действия Цит-КЛ в цитируемой статье [179] былапредложена схема (Рис. 36).ОднимизвозможныхсобытийявляетсявзаимодействиеЦитС,выделенного из наночастиц Цит-КЛ внутри цитоплазмы (Стрелки 1, 2 и 3 наРис. 36), с другими апоптотическими белками, которые индуцируют активациюкаспазного каскада, приводя к смерти клетки.
Несмотря на свою простоту, этотмеханизм кажется сомнительным, так как ЦитС имеет очень высокое сродствок кардиолипину, так что он скорее извлек бы из двухслойной мембраныкардиолипин, чем высвободил бы его в такую сильнополярную среду, как вода.ВторойспособдействияЦит-КЛ–этоегопроникновениечерезцитоплазматическую мембрану (стрелки 1 и 2, правая), затем через внешнююмитохондриальную мембрану (стрелка 4) и последующее включение вовнутреннюю мембрану митохондрий (5 на Рис. 36). Согласно нашим данным,комплексЦит-КЛявляетсягидрофобнойнаносферой,способнойкатализировать реакции липидной пероксидации, находясь в гидрофобномокружении, содержащем субстраты окисления в форме углеводородныхостатковполиненасыщенныхжирныхкислотфосфолипидов(раздел«Результаты и Обсуждение», пункты 0 и 4.3). Уже после выхода в светцитируемой статьи [179] мы поставили специальную серию опытов, в которых99было показано, что добавление комплекса Цит-КЛ к суспензии изолированныхмитохондрий вызывает липидную пероксидацию в митохондриальныхмембранах, что напрямую подтверждает развитие событий 5, 6, 7 на Рис.
36. Ниотдельно ЦитС, ни кардиолипин, добавленные по-отдельности, не проявлялиподобного эффекта. Мы можем предположить, что наносфера Цит-КЛ будетдиффундировать во внутренней мембране митохондрий вдоль мембранноголипидного слоя (событие 6 на Рис. 36) до тех пор, пока не достигнет комплексаVDAC-ANT, осуществляя пероксидацию липидов (Сравни дискуссию в статьях[176] и [122]). Как известно уже довольно давно, перекисное окисление липидовприводит к разбуханию митохондриальной матрицы [83, 84, 134] и открытиюмегапор в наружной митохондриальной мембране [135].
В культурах клетокпероксидация кардиолипина непосредственно предшествовала выходу ЦитС измитохондрий [155]. Следовательно, развитие апоптоза по путям 1-2, 4-7 (Рис.36) находится в хорошем согласии как с нашими, так и с литературнымиданными.Третий возможный способ гибели клеток, также согласующийся с нашимиэкспериментами, показан на Рис. 36, 9.
Согласно этой гипотезе, Цит-КЛвключается непосредственно в клеточную мембрану и катализирует тамперекисное окисление липидов. За этим следует появление фосфатидилсерина(PS) на поверхности клетки. PS – это сигнал «съесть меня» для макрофагов,которые распознают поврежденную клетку и уничтожают ее. Механизмыперекисного окисления липидов в клеточной мембране, катализируемые ЦитСи сопровождающиеся инактивацией скрамблазы, окислением PS и егоэкстернализацией, подробно описаны в литературе [90, 150].Таким образом, наши исследования показали, что комплекс Цит-КЛ можетоказать апоптогенное и токсическое действие на раковые клетки не хужеизвестных противораковых препаратов, от которого он отличается тем, чтопреодолевает резистентность клеток к лекарствам.
Было показано, что в основепротиворакового действия Цит-КЛ лежит особенность его структуры и егоспособность растворяться в гидрофобной среде, в том числе в мембранах100митохондрий и катализировать там образование липидных радикалов, что иприводит к программируемой гибели клеток – апоптозу (а возможно, иферроптозу).6ВЫВОДЫ1. Отработаны условия получения и методы изучения строенияпероксидазной активности комплекса цитохрома с с кардиолипином(Цит-КЛ) в неполярной среде.2. Исследованы размеры наносфер комплекса и соотношение липид-белокв комплексах Цит-КЛ в неполярном окружении (гидрофобныхрастворителях). Частицы комплекса Цит-КЛ в неполярном окруженииимеют размер 7,8 ± 1,0 (при соотношении липид:белок, равном 13) и12,1 ± 1,4 нм (при соотношении липид:белок, равном 59).Эти данныебыли сопоставлены со строением Цит-КЛ в микрокристаллическихосадках и разбавленных водных растворах.
Размеры частиц Цит-КЛ внеполярном окружении совпадают с размерами этих частиц вмикрокристаллическом осадке, а соотношение липид:белок в Цит-КЛ,помещенных в неполярную среду, соответствует аналогичномусоотношению в разбавленных водных растворах Цит-КЛ с точностьюто ошибки измерения.3. Исследованы изменения конформации цитохрома c при переходе изводного раствора в комплекс Цит-КЛ и в водно-метанольный раствор.Конформация ЦитС, входящего в состав Цит-КЛ, помещенного внеполярноеокружение,отличаетсяотнативной:разрушеныжелезосерные связи между гемовым железом и серой метионина Met80(исчезает поглощение при 699 нм) и увеличено расстояние от гема доостатков тирозина и триптофана (появляется флуоресценция при 307310 и 330 нм).
Конформация ЦитС, помещенного в водно-метанольнуюсреду, изменена таким же образом. Это говорит о том, что в данномслучае структурные изменения – это частичное плавление глобулы. Оно101обратимо, о чем говорят данные по поглощению при 699 нм в системеметанол-цитохром.4.
Исследована возможность изучения образования свободных радикаловв липопероксидазных реакциях, катализируемых комплексом Цит-КЛ,методом хемилюминесценции, активированной изохинолизиновымикумариновыми красителями С-525 и С-334. Было обнаружено, чтокумариновые активаторы хемилюминесценции (С-525, С-314 и С-334),ранее используемые при исследованиях образования пероксильныхрадикалов в мембранных системах, разрушаются в ходе пероксидазнойреакции, катализируемой комплексом Цит-КЛ. Однако было выяснено,что этот процесс не сопровождается хемилюминесценцией.
Кроме того,мы показали, что за время измерения кинетических кривыххемилюминесценции происходит разрушение не более 29% С-334, 48%С-525 и 39% С-314. Таким образом, выводы об образовании свободныхрадикалов и о механизме реакций, полученные при анализе кинетикихемилюминесценции, могут быть сделаны без внесения поправок начастичное разрушение участников реакции реагентов.5. Путем регистрации кинетики хемилюминесценции в присутствииактиваторов С-334 и С-525 изучено образование свободных радикаловв липопероксидазных реакциях, катализируемых комплексом Цит-КЛ,методом активированной кумаринами хемилюминесценции в среде,состоящей из гидрофобного растворителя. Было показано образованиелипопероксильныхрадикаловприокисленииприродногокардиолипина в водных растворах и в неполярных растворителях,катализируемое комплексом Цит-КЛ.
Было показано, что радикалыобразуются в двух реакциях – разложение гидропероксидов липидов ипероксидациякардиолипинавприсутствииH2O2(квази-липоксигеназная и липопероксидазная реакции). Антиоксидантытролокс и дигидрокверцетин угнетали образование радикалов влипопероксидазной реакции в концентрациях порядка десятой доли102мкМ. Механизм реакций, судя по форме кинетических кривых, быланалогичен механизму ингибирования других пероксидазных реакций,ранее изученных в нашем коллективе.6. Реакция липидной пероксидации протекает при действии комплексаЦит-КЛ на изолированныемитохондрии, преимущественно навнутренниечеммембраны,хемилюминесценцииосуспензииговоритфактшокированныхинтенсивноймитохондрийвприсутствии Цит-КЛ и пероксида водорода.7.
В совокупностиобнаруженногонаши результатывсовместнойпоказывают, чтоработеснашиммеханизмучастиемапоптотического и цитотоксического действия Цит-КЛ на раковыеклетки может включать в себя катализ липидной пероксидации вмембранахмитохондрий,липопероксильныхлипопероксидазныхкоторыйрадикаловреакциях.вприводиткобразованиюквази-липоксигеназнойБыларазработанаисхемапоследовательных процессов в клетке, заканчивающаяся их гибелью.Эти данные могут послужить началом создания нового типалекарственных препаратов, которые, будучи элементами самой клетки,оказываютдействиенараковыесинтетическим препаратам.103клетки,нечувствительныек7СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
