Диссертация (Структура и пероксидазная функция комплекса цитохрома c с кардиолипином в водной среде и в неполярном окружении), страница 6

Молекула цитохрома сокружена монослоем кардиолипина, её объем увеличен, и структура серьёзноизменена (расплавленное состояние глобулы) [173].Включение цитохрома c в оболочку из молекул кардиолипина даётвозможность этому комплексу, имеющему гидрофобную поверхность,проникать в толщу липидного бислоя и осуществлять катализ липиднойпероксидации, а также проходить через липидный бислой мембран [9], в томчисле и в цитозоль, и индуцировать таким образом апоптоз.Большой интерес представляет информация, содержащаяся в обзоре [80],о том, что смена конформации цитохрома c при его взаимодействии с33кардиолипином может способствовать не только его выходу в цитозоль, но иего транспорту в ядро. Так, вблизи ядрышка был обнаружен конгломерат измолекулы цитохрома c и заблокированных гистоновых шаперонов SET/ TAFIβ, препятствующий сборке нуклеосом.

Иными словами, цитохром c, помимовсего прочего, может блокировать репликацию и экспрессию генов, однакомеханизм миграции цитохрома c в ядро и его выхода в цитоплазму без запускаапоптоза остаётся неизвестным.Необходимо также отметить, что образование комплекса цитохрома c скардиолипином – обратимое явление, комплекс чувствителен к высокой ионнойсиле среды и окислению кардиолипина [80].2.2.5 Получение Цит-КЛ в неполярной средеВ работе А.С.

Викулиной и сотрудников [166] было показано, чтокомплекс может быть успешно экстрагирован в гидрофобную хлороформеннометанольнуюфазупометодике,оченьблизкойкэкстрагированиюфосфолипидов по Фолчу [71]. Получение раствора комплекса Цит-КЛ вгидрофобной среде позволяет изучать его свойства в условиях, приближенныхк условиям, в которые попадает наносфера Цит-КЛ, проникая в липидныйбислой биологических мембран [18]). Следует, однако, отметить, что на данныймомент комплекс Цит-КЛ в гидрофобном растворителе не охарактеризован нис точки зрения его структуры, ни с точки зрения его пероксидазной функции.2.3 Пероксидазная функция комплекса Цит-КЛВне комплекса с кардиолипином цитохром с выполняет функцию переносаэлектронов в дыхательной цени и практически не обладает пероксидазнойактивностью.

Образование комплекса цитохрома c с кардиолипином меняет егосвойства и функцию: комплекс катализирует липидную пероксидацию вовнутренней митохондриальной мембране, что приводит к нарушениюбарьерных свойств внутренней мембраны, набуханию матрикса, появлениюмегапор в наружной мембране, выходу цитохрома c из межмембранногопространства в цитоплазму и запуску апоптотического каскада [12, 19, 92].34Систематические исследования пероксидазной активности мембраносвязанного цитохрома с в лаборатории В. Кагана были начаты в 2006 году сиспользованием метода ЭПР и спектрофлуориметрии для обнаруженияобразованияпродуктовпероксидазнойпероксидазнойактивностикомплексареакции[47].Дляизученияцитохромас скардиолипиномиспользовался метод хемилюминесценции в присутствии люминола в качествевторого субстрата пероксидазных реакций [15, 17, 21, 24, 28, 33]. Этимиметодами был получен в принципе один и тот же результат: пероксидазнаяактивность цитохрома с увеличивалась при образовании комплекса Цит-КЛ вомного десятков раз [47, 99].Пероксидазная активность подразумевает наличие H2O2 в качестве первогосубстрата реакций пероксидазного цикла, однако для мембранно-связанногоцитохрома с было показано, что вместо пероксида водорода первым субстратомможет быть трет-бутил гидропероксид, а также гидропероксиды жирныхкислот [46, 163].В роли второго субстрата в реакциях классического пероксидазного цикламогут выступать остатки ПНЖК.

Такие реакции могут быть названы квазилипооксигеназнымивтомслучае,когдапервымсубстратомбудетгидропероксид органического соединения, и липопероксидазными, когда в ролипервого субстрата будет выступать пероксид водорода. Во всех этих реакцияхпервично образуются липидные алкильные радикалы, которые затем активновзаимодействуют с растворенным кислородом, образуя диоксид (пероксил)радикалы.Взаимодействиепоследнихдругсдругомвреакциидиспропорционирования сопровождается сверхслабым свечением [11, 13, 170].Вприсутствиифизическогоактиваторахемилюминесценцииизохинилизинового кумарина C-525 свечение усиливается более чем на трипорядка величины в результате переноса энергии электронного возбуждения наактиватор [180].

При добавлении ЦитС к бычьему кардиолипину, содержащемуполиненасыщенные жирные кислоты и гидропероксиды липидов, всегдаприсутствующие в препаратах, наблюдается вспышка хемилюминесценции,35свидетельствующая о протекании пероксидазных реакций [15, 20, 28]. Этавспышка имела место также и в том случае, если субстратом окисления былалинолевая кислота, содержащая гидропероксиды (LOOH).Также,какиструктурныесвойствакомплексаЦит-КЛ,егофункциональная активность на данный момент изучалась исключительно вводной среде, между тем как для более адекватного моделированияфункционирования комплекса внутри липидного бислоя митохондриальныхмембран полезнее было бы изучить его ферментативную активность внеполярных растворителях.Изучение ферментативной активности комплекса Цит-КЛ при еговзаимодействии с самими митохондриальными мембранами вообще непроводилось.

Равно как нам неизвестны работы по изучению кинетикиобразования липидных радикалов комплексом Цит-КЛ с целью расшифровкимеханизма реакций и определения констант скоростей этих реакций.Представляется необходимым сделать это известными методами кинетическойхемилюминесценции, основанными на изучении нестационарной кинетикиреакций и математическом моделировании этих реакций [22].Причина отсутствия пероксидазной активности у цитохрома c и появлениятакой активности в комплексе с кардиолипином неоднократно обсуждалась влитературе.

Известно, что к появлению пероксидазной активности у цитохромас может приводить его химическая модификация [65]. Так, наблюдалосьувеличение пероксидазной активности цитохрома с в 2,5 раза при действиинебольшого (2–5 раз по отношению к цитохрому с) избытка пероксидаводорода. При этом образовывался модифицированный цитохром c с частичноразорванной связью между гемовым железом и серой метионина, находящегосяв 80-м положении (>Fe∙∙∙S(Met80)), о чем свидетельствовало снижениепоглощения цитохрома c при 699 нм. Связь >Fe∙∙∙S(Met80) отсутствует во всехклассических пероксидазах, а ее наличие, судя по всему, препятствуетпроникновениюпервогосубстратапероксидазнойреакции, пероксидаводорода, в активный центр фермента [24].

К разрыву связи >Fe∙∙∙S(Met80)36приводит также и протеолиз цитохрома с. Обработка цитохрома с трипсином,как известно, приводит к образованию микропероксидаз. Поглощением придлине волны 699 нм микропероксидазы не обладают, а это означает, чтокоординационная связь >Fe∙∙∙S(Met80) в них не существует. Микропероксидазыобладают существенно более высокой пероксидазной активностью посравнению с цитохромом с [43].

При окислении цитохрома с гипохлоритомтакже происходит модификация и разрыв связи >Fe∙∙∙S(Met80) [59].Однако в некоторых случаях разрушения связи >Fe∙∙∙S(Met80) былонедостаточно для появления у цитохрома с свойств пероксидазы [23]. С другойстороны,приобразованиикомплексаЦит-КЛ,которомуприсущапероксидазная активность, появляется отсутствующая у нативного цитохромас флуоресценция остатков тирозина и триптофана, что говорит о том, чтомолекула цитохрома с в составе комплекса оказывается в так называемомрасплавленном состоянии, когда белок частично денатурирован [47, 100].

Стоитотметить, что как поглощение связей >Fe∙∙∙S(Met80), так флуоресценцияостатков тирозина и триптофана в цитохроме с изучались в водных растворах.Под пероксидазной активностью цитохрома c понимается его способностькатализировать окисление органических соединений в присутствии H2O2 [24].Активный центр классических пероксидаз по структуре напоминает гемцитохрома c, но только у них вместо связи >Fe∙∙∙S(Met80) – вакантная связь длясвязывания с молекулой H2O2 в самом начале пероксидазного цикла [19].Однако разрушение железосерной связи в молекуле цитохрома c – неединственная и не главная причина появления пероксидазной активности: сампо себе разрыв 70% связей приводил лишь к трёхкратному увеличениюпероксидазной активности, тогда как в той же серии опытов связывание слипосомами, содержащими кардиолипин, приводило к восьмикратнойактивации пероксидазной активности.

Основную роль играет, по-видимому,специфическая перестройка молекулы цитохрома c, характерная именно длякардиолипина [24], описанная выше. Если же говорить об эффективномсоотношении молекул белка и кардиолипина, то оптимум пероксидазной37активности комплекса достигается обычно при соотношении кардиолипина кбелку в пределах 20:1 до 100:1 [19].Таким образом, можно предложить следующий механизм специфическогоусиления пероксидазной активности комплекса цитохрома c с кардиолипином:связывание кардиолипина (механизм описан выше) → изменение конформацииучастка глобулы (иное чем то, от которого зависел разрыв связи >Fe∙∙∙S(Met80)→ увеличение доступности активного центра для H2O2, растворённого вокружающей белок водной среде → резкое ускорение окисления органическихсубстратов пероксидом водорода [23].