Диссертация (Структура и пероксидазная функция комплекса цитохрома c с кардиолипином в водной среде и в неполярном окружении), страница 8

(«Sigma», США)• метанол квалификации не ниже х.ч. («Sigma», США)• н-гексан квалификации не ниже ч.д.а3.2 АппаратураХемилюминесценциюизмерялинахемилюминометрахLum-100(ИнтерОптика-С, Россия). Для сопряжения компьютера и хемилюминометраиспользовали оригинальный программный продукт PowerGraph (версия 3.3,разработчик Измайлов Д.Ю.). Спектры поглощения регистрировали сиспользованием двухлучевого спектрофотометра Analytic Jena SPECORD 200(Германия). Флуоресценцию измеряли на спектрофлуориметре RF-5301(Shimadzu Corporation, Япония).Измерения динамического светорассеяния проводились на прибореZetasizer Nano ZS (Malvern, Великобритания).Данные, полученные хемилюминесцентными и спектроскопическимиметодами, обрабатывали в Microsoft Office Excel.

Данные по динамическому45светорассеянию обрабатывали с помощью официального программногообеспечения Malvern «Zetasizer Software».3.3 Подготовка объектов исследования3.3.1 Приготовление комплекса Цит-КЛ в неполярном растворителеВ значительной части, если не в большинстве, работ, посвященныхизучению строения комплекса цитохрома c с кардиолипином, авторыиспользовали природный (бычий) кардиолипин, в котором жирнокислотныеостатки состоят преимущественно из линолевой кислоты, легко окисляющейсякислородом воздуха и повреждающий при этом окислении цитохром с. В нашихопытахмыиспользовалисинтетическийфосфолипид1,1’,2,2’-тетраолеилкардиолипин, устойчивый к спонтанному окислению [47].

Приинкубации Цит-ТОКЛ в течение обычного времени экспериментов мы ненаблюдали ни образования липидных радикалов методом хемилюминесценции,ни деградации гема цитохрома c, оцененного спектрофотометрически (Рис. 13).1,61,4ЦитСПоглощение, А1,2Цит-КЛ 0 минЦит-КЛ 3 мин1Цит-КЛ 6 мин0,8Цит-КЛ 21 мин0,60,40,20350400Длина волны, нм450500Рис. 13. Отсутствие изменений гема цитохрома c в комплексе с ТОКЛ при инкубации.Состав пробы: ЦитС 10 мкМ, ТОКЛ 600 мкМ в водном растворе, содержащем 1%метанола (растворитель ТОКЛ).46Приготовление раствора комплекса Цит-КЛ осуществлялось по методуэкстракции липидов по Фолчу [71] и методике, описанной Викулиной А.С.[166], но с некоторыми изменениями.Метод Фолча был разработан для выделения фосфолипидов из тканей.Сущность метода заключается в том, что к ткани добавляют 20-кратныйизбыток смеси хлороформа и метанола, взятых в объемном соотношении 2:1.При этом, белки из ткани либо оставались в водной фазе, либо попадали впленку на границе водно-метанольной и хлороформенно-метанольной фаз.

Вработе Викулиной А.С. [166], выполненной на кафедре медицинскойбиофизики ФФМ МГУ, описанная ниже процедура, сходная с предложеннойФолчем, была использована для получения раствора комплекса Цит-КЛ вгидрофобной среде.Согласно этой процедуре, сначала готовят раствор цитохрома с вфосфатном буферном растворе, к которому затем добавляют растворкардиолипина в метаноле. Полученную смесь перемешивают, добавляют к нейсмесь хлороформа и метанола, взятых в объемном соотношении 2:1.Полученную смесь хорошо встряхивают и оставляют на некоторое время илиже центрифугируют до расслоения фаз.

Нижняя фаза при этом окрашивается валый цвет, что говорит о переходе комплекса Цит-КЛ в хлороформ. При этом,отмечается, что без метанола переход комплекса Цит-КЛ в хлороформ непроисходит.3.3.2 Приготовление изолированных митохондрий из печени крысМитохондрии выделяли из печени самцов крыс линии Wistar (275±25 г)[158]. Крыс декапитировали под действием эфира. Все манипуляции проводилипри температуре 0-4 °C на льду. Образец печени массой около 4 г промывали вбуферном растворе выделения (10 мМ HEPES, 1 мМ EGTA, 70 мМ сахароза и200 мМ маннитол, рН 7,50 все Sigma-Aldrich), затем гомогенизировали спомощью специального стеклянного гомогенизатора с тефлоновым пестикомво избежание повреждения митохондрий в 40 мл раствора выделения,47содержащем 1 мг/мл дилипидированного бычьего сывороточного альбумина(Sigma-Aldrich, США) с помощью специального стеклянного гомогенизатора стефлоновым пестиком во избежание повреждения митохондрий.

Полученнуюсуспензию центрифугировали при 600g в течение 5 минут. Надосадочнуюжидкость отделяли и центрифугировали при 11000g в течение 10 минут.Надосадочную жидкость удаляли, осадок ресуспензировали в 40 мл буферногораствора выделения. Полученную суспензию центрифугировали при 600g втечение 5 минут. Надосадочную жидкость отделяли и центрифугировали при11000g в течение 10 минут. Надосадочную жидкость удаляли, осадокресуспензировали в буферном растворе хранения (10 мМ HEPES, 250 мМсахароза, 1 мМ АТФ, 0,08 мМ АДФ, 5 мМ сукцинат натрия и 2 мМ KH2PO4, рН7,50) при температуре 0–4 °C на льду. Далее, для получения митохондрий cнарушенной целостностью внешней мембраны cуcпензию митохондрийзамораживали при –20°C, после чего размораживали и хранили притемпературе 0–4°C на льду.3.4 Методы исследования структуры цитохрома c в комплексе скардиолипином3.4.1 Спектрофотометрическое определение состояния железосерныхсвязей в ЦитСОбъем анализируемого раствора составлял 3 мл.

Регистрировали спектр вобласти 650-750 нм.Использовали 400 мкМ раствор ЦитС в 20 мМ фосфатном буферномрастворе, к которому добавляли растворы метанола различной концентрации.В литературе железосерным связям приписывают максимум поглощенияпри 695 нм [19]. В действительности, максимум пика наблюдается при длиневолны 699 нм, если вычесть из спектра ЦитС спектры, характерные для всехприсущих этому веществу связей, кроме железосерных, что можноосуществить простым вычитанием наклонной кривой. Расчет истинногопоглощения при 699 нм подразумевает вычитание фонового поглощения. Для48этого для каждой пробы использовали следующее уравнение: AFe-S = A699 ─ (A670+ A728)/2. Его вывод основан на том, что длина волны 699 нм находится точнопосредине между длинами волн 670 нм и 728 нм, и на том, что при 699 нм лежитмаксимумпоглощенияжелезосерныхсвязей.Былоустановлено,чтомаксимальный эффект наблюдается при объемной доле метанола 65%:дальнейшее увеличение концентрации метанола не давало дополнительногоэффекта.

Таким образом, поглощение при 699 нм, наблюдаемое при 65%метанола, было принято за 0.3.4.2 Измерение спектров поглощения смеси для регистрации ХЛпероксидазных реакций, катализируемых Цит-КЛРегистрация оптической плотности проводилась в кварцевых кюветах приследующих параметрах прибора: диапазон измерений: 300-600 (750) нм,ширина щели – 5 нм, шаг – 0,5 нм, скорость – 5 нм/с.,При измерении кинетики разрушения цитохрома c и кумариновыхсенсибилизаторов мы добавляли в кювету спектрофотометра 300 мкл 100 мкМраствора цитохрома c, 150 мкл 6 мМ ТОКЛ, 75 мкл 1 мМ раствора кумарина С334 или 150 мкл 500 мкМ раствора кумарина С-314 или С-525, а также - 300 мкл2150 мкМ раствора перекиси водорода (в контрольных измерениях H2O2заменялась фосфатным буфером), общий объём пробы составляет 3 мл, данныйобъём доводится добавлением необходимого объёма 20 мМ фосфатногобуфера.

Перекись водорода добавлялась в последнюю очередь. С помощьюсекундомера измеряли время от начала реакции (добавление перекисиводорода) до начала первого измерения спектра, проводимого при следующийпараметрах: диапазон измерения 300-600 нм, скорость измерения 5 нм/с, шаг0,5 нм, ширина щели 5 нм, время регистрации спектра - примерно 1 мин. Далеес интервалами 10 секунд регистрировали данный спектр ещё 6 раз, после чего синтервалом 1 мин регистрировали спектр поглощения ещё 23 раза, после чего– ещё 26 раз с интервалом 2 мин.49Алгоритм добавления, объёмы растворов и данные концентрациилипопероксидов и перекиси водорода были подобраны по результатамподготовительных экспериментов, а концентрации ЦитС и ТОКЛ взяты срасчётом на оптимальное соотношение ЦитС:ТОКЛ (1:30), показанное в работе[176].3.4.3 Измерение спектров флуоресценции3.4.3.1 Регистрация триптофановой и тирозиновой флуоресценции в ЦитСИзмерения проводились на приборе RF-5301 PC (Shimadzu, Япония).использовались кварцевые кюветы с длиной оптического пути 5 мм.В кювету для флуоресценции отбирали 200 мкл 20 мкМ раствор ЦитС в 20мМ фосфатном буферном растворе, добавляли к ним 200 мкл воды илиметанола, измеряли флуоресценцию в области 300-400 нм при длине волнывозбуждения 289 нм.

Для устранения пика комбинационного рассеяния воды изспектров проб, содержащих ЦитС вычитали спектры проб, в которых вместоЦитС добавлялся тот же объем воды.Для спектрофлуориметрического исследования комплекса Цит-КЛ вгидрофобном окружении пробу для спектрофотометрического исследованиякомплекса Цит-КЛ (см. раздел 3.4.1) упаривали в токе азота и перерастворялиполученный осадок в гексане.3.4.3.2 Регистрация спектров флуоресценции кумариновых красителейИзмерения проводились на приборе RF-5301 PC (Shimadzu, Япония).использовались кварцевые кюветы с длиной оптического пути 5 мм. Измерялиспектры флуоресценции при длине волны возбуждения 265 нм в областифлуоресценции красителя.3.4.4 Метод динамического светорассеяния для изучения размера частицкомплекса Цит-КЛИзмерения проводились на приборе Zetasizer Nano ZS (Malvern,Великобритания) в кварцевой кювете. Непосредственно перед измерением50образцы подвергались центрифугированию для осаждения мешающих анализукрупных частиц.

Для получения приведенных здесь данных о размерах частицна приборе Zetasizer Nano ZS с помощью официального программногообеспечения Malvern «Zetasizer Software» осуществляется ряд процедур.исходный сигнал, получаемый на приборе – это интенсивность света,рассеянного частицами в растворе, регистрируемая во времени. Скоростьдвижения частиц в растворе, в соответствии с законом Стокса, зависит отразмера частиц. Для оценки размера частиц прибор последовательно сдвигаетполученнуюкривую«интенсивность-время»наопределенноеΔt,ирассчитывает коэффициент корреляции для данного Δt по отношению кисходной кривой. В результате мы получаем коррелограмму, на которой поординате откладывается коэффициент корреляции, а по абсциссе – Δt.

Исходяиз Δt, при котором коэффициент корреляции начинает резко снижаться, ПОрассчитывает распределение числа частиц в растворе по их размеру, исходя изинтенсивности света, рассеянного частицами. Такое распределение даетнесколько завышенное значение среднего геометрического размера частиц, таккак частицы большего размера рассеивают больше света (при этоминтенсивность рассеянного света пропорциональна шестой степени диаметрачастиц). Используя теорию Ми, ПО может построить Number PSD –распределение числа частиц по их диаметру. В таком случае полученныйсредний размер частиц точнее определяет их геометрические размеры [157].Для этих расчетов необходимо ввести в ПО Zetasizer значения показателейпреломления частиц и растворителя, а также значения поглощения частиц придлине волны 633 нм и динамической вязкости растворителя.