Диссертация (Структура и пероксидазная функция комплекса цитохрома c с кардиолипином в водной среде и в неполярном окружении), страница 2

Нарушениянормального течения процесса апоптоза приводят к развитию многихпатологий [113, 145, 159], в том числе и к онкологическим заболеваниям.Согласно данным PubMed, c 2014 года публикуется не менее 4,5 тысяч статей вгод, в названии которых присутствует слово «apoptosis».Особенностьюраковыхклетокявляетсято,чтоониспособныингибировать апоптоз. В последние годы появляется все больше и большедоказательств того, что многие (а, возможно, и все) агенты противораковойхимиотерапии вызывают смерть опухолевых клеток in vitro и in vivo за счетзапуска механизмов апоптоза [81]. К сожалению, раковые клетки быстровырабатывают механизм выброса чужеродных, в том числе и противораковыхлекарственных средств.

Необходим поиск и разработка более эффективнойраковой терапии. Новым подходом в борьбе с раковыми клетками можетслужить использование природного инициатора апоптоза – комплексацитохрома с с кардиолипином.Каган и сотрудники показали, что для развития апоптоза необходимообразование Цит-КЛ и проявление им пероксидазной активности. При этом,подразумевалось, что Цит-КЛ представляет из себя мембранно-связанныйЦитС. Однако недавно в нашем коллективе было показано, что существует идругая структура данного комплекса, а именно – наносфера Цит-КЛ, в котороймолекула цитохрома с находится в центре и окружена монослоем молекулкардиолипина.

Было сделано предположение, что в митохондриях даннаянаносфера может встраиваться в толщу липидного слоя мембраны, где она иосуществляет пероксидазную функцию. В подтверждение того, что такаянаносфера может проникать в липидный бислой, обладающий гидрофобными7свойствами, было показано, что комплекс Цит-КЛ может быть растворен вгидрофобном растворителе. Однако структурные и функциональные свойствакомплекса Цит-КЛ если и были в какой-то мере изучены, то исключительно вводной фазе.

Поэтому актуальным является исследование структуры ипероксидазной функции комплекса Цит-КЛ в гидрофобной среде. В этой жесреде необходимо исследовать и функцию комплекса Цит-КЛ. Такой функциейявляется образование свободных радикалов как первичного продуктапероксидазной реакции. В нашей лаборатории были разработаны уникальныеметоды изучения реакций с образованием свободных радикалов, основанные нарегистрации кинетики хемилюминесценции в присутствии специфическихактиваторов ХЛ и математическом моделировании кинетики реакций.Применение этих методов для изучения функции комплекса Цит-КЛ вгидрофобной фазе является таким образом актуальной научной проблемой.Цели и задачиЦелью данной работы является получение новых данных о комплексецитохрома с с кардиолипином (Цит-КЛ): данных о его размере, химическомсоставе, конформации белка в комплексе и о механизме образования имсвободных радикалов в гидрофобном окружении, в котором он выполняет своюроль триггера программируемой смерти клеток – апоптоза.Решение этой фундаментальной научной проблемы позволит приступить ксозданию действующего начала противораковых средств нового типа на основеприродных и синтетических белок-липидных комплексов, по структуре идействию аналогичных Цит-КЛ.Для решения этой цели в работе были поставлены следующие задачи:1.

Отработать условия получения и методы изучения строения ипероксидазной активности комплекса цитохрома с с кардиолипином(Цит-КЛ) в гидрофобных растворителях.2. Исследовать размеры наносфер комплекса и соотношение липид-белокв комплексах Цит-КЛ в неполярном окружении (гидрофобных8растворителях) и сравнить эти данные со строением Цит-КЛ вмикрокристаллических осадках и разбавленных водных растворах.3. Исследовать изменения конформации цитохрома c при переходе изводного раствора в комплекс Цит-КЛ и в водно-метанольный раствор.4. Исследовать возможность изучения образования свободных радикаловв липопероксидазных реакциях, катализируемых комплексом Цит-КЛ,методом хемилюминесценции, активированной изохинолизиновымикумариновыми красителями С-525, С-334 и С-314.5.

Изучить образование свободных радикалов в липопероксидазныхреакциях,катализируемыхкомплексомЦит-КЛ,методомактивированной кумаринами хемилюминесценции в среде, состоящейиз гидрофобного растворителя.6. Изучить образование свободных радикалов в липопероксидазныхреакциях,катализируемыхактивированнойкумаринамикомплексомЦит-КЛ,хемилюминесценциивметодомсистеме,содержащей митохондриальные мембраны.7.

Изучить роль реакций липидной пероксидации в цитотоксическом иапоптогенном действии комплекса Цит-КЛ на обычные и лекарственноустойчивые раковые клетки в клеточной культуре.Теоретическая и практическая значимость работыДанные, полученные в диссертации, позволили раскрыть механизмапоптогенного и цитотоксического действия комплекса Цит-КЛ на раковыеклетки в культуре. Это явление было открыто в совместной работе группыамериканских и российских ученых с участием автора; оно дает возможность вдальнейшем начать поиск противораковых агентов нового типа – белковолипидных комплексов с пероксидазной активностью, против которых раковыеклетки не обладают резистентностью.9Разделы диссертации, относящиеся к строению и каталитической функциикомплекса Цит-КЛ, вошли в лекционный курс по медицинской биофизике,читаемый студентам Факультета Фундаментальной медицины МГУ.Научная новизна работыВ работе впервые было проведено систематическое изучение размеракомплекса цитохрома c с кардиолипином (Цит-КЛ) в гидрофобном окружениии был выяснен механизм пероксидазных реакций, катализируемых этимкомплексом.

Было показано, что в гидрофобном растворителе частицы Цит-КЛимеют преимущественно два размера около 12 и 8 нм, что совпадает сразмерами наносфер в микрокристаллах комплекса, изученных ранее. Былопоказано, что белковая глобула в Цит-КЛ находится в частично расплавленномсостоянии, что делает ее каталитически активной. Было показано, что вразбавленных водных растворах и в гидрофобном растворителе комплекс ЦитКЛ катализирует образование липидных радикалов по тому же механизмупероксидазного цикла, что другие, ранее изученные, пероксидазы. Былообнаружено, что эти же реакции протекают в мембранах митохондрий поддействием добавленных извне частиц Цит-КЛ.

Таким образом, были полученыновые фундаментальные знания о свойствах и способе функционированиякомплекса цитохрома c при апоптозе.Положения, выносимые на защиту1. Отработаны условия получения и методы изучения строениякомплекса цитохрома с с кардиолипином (Цит-КЛ) в гидрофобныхрастворителях.2. Размер частиц комплекса Цит-КЛ в неполярном окружениисоставляет 7,8 ± 1,0 и 12,1 ± 1,4 нм. Таким образом, частицыкомплекса в неполярной среде имеют такие же размеры, как ичастицывкристаллическихосадкахЦит-КЛСоотношениелипид:белок в этих частицах составляет 13 и 59, соответственно.103.

КонформацияЦитСвкомплексеЦит-КЛ,помещенномхлороформную фазу, отличается от нативной и представляет собойрасплавленную глобулу, в которой разрушены железосерные связимежду гемовым железом и серой метионина Met80 и увеличенорасстояние от гема до остатков тирозина и триптофана. Такие жеизменения происходят и в ЦитС, в водно-метанольной среде.

Этиизменения обратимы.4. Кумариновые активаторы хемилюминесценции (С-525, С-334 и С314), являются субстратом пероксидазной реакции, катализируемойкомплексом Цит-КЛ. Однако эта реакция не сопровождаетсяхемилюминесценцией, а сами активаторы за время типичногоэксперимента по изучению реакций Цит-КЛ разрушаются лишьчастично. Поэтому все три соединения (С-314, С-334 и С-525) могутслужить в качестве активаторов хемилюминесценции.5.

Комплексцитохромасскардиолипиномкатализируетпероксидазные реакции липидов не только в водных растворах, но ив неполярном окружении, в котором комплекс, по-видимому,находится в мембранах клеток и митохондрий.6. Реакции липидной пероксидации с образованием радикаловпротекают при действии комплекса Цит-КЛ на митохондриальныемембраны.7. Обнаруженноевсовместнойработеапоптотическоеицитотоксическое действия Цит-КЛ на раковые клетки обусловленообразованием липидных радикалов в липопероксидазных реакциях.Личный вклад автораАвтор проводил все эксперименты, результаты которых представлены вдиссертационной работе, кроме экспериментов на раковых клетках, которыеприведены в работе в разделе «Дискуссия» со ссылкой на публикацию.

Личноавтором были проведены обработка и интерпретации всех полученных данных.11Апробация результатов исследованияРезультатыконференцияхисследованиясдоложенымеждународнымвустныхучастием:«II-аявыступленияхнаМеждународнаяКонференция «Свободные радикалы в химии и жизни»» (Белоруссия, Минск,2017), «16th International Nutrition and Diagnostics Conference» (Чехия, Прага,2016), «9th International Conference «Biomaterials and nanobiomaterials: Recentadvances safety-toxicology and ecology issues»» (Греция, Ираклион, 2018)Апробация работы прошла на совместном заседании коллективасотрудников кафедры Медицинской биофизики Факультета фундаментальноймедицины, ФГБОУ ВО МГУ им. М.В.