Диссертация (Структура и пероксидазная функция комплекса цитохрома c с кардиолипином в водной среде и в неполярном окружении), страница 4

Это чётко было показано для макрофагов ираковых клеток, между тем как сам ●NO в ряде случаев может предотвращатьапоптоз у других клеток.Fe2+ резко ускоряет пероксидацию полиненасыщенных жирных кислот, втом числе и в составе липидов мембран:ROOH + Fe2+ → Fe3+ + HO͞ + RO● →… RO● → … ROO●Важно отметить, что свободные радикалы могут возникать также врезультатерядафизическихфакторов:обработкиультразвукомиэлектромагнитным (в том числе и радиационной) излучением [1, 8, 29].Было также показано, что одним из наиболее важных молекулярныхпредшественников свободных радикалов в организме является хлорноватистаякислота (HOCl) и гипохлорит-анион [34], образующиеся по реакции:Н2О2 +Cl‾ + H+ → HOCl + H2O19NO-СИНТАЗАРис.

2. Двойственная роль свободных радикалов в клетке [7]На Рис. 2 схематично показаны биохимические пути свободных радикаловв клетке. В цитозоле перекись водорода может способствовать тиолдисульфидному переходу в белках цитоплазмы, в частности идёт реакция,катализируемая глутатион-пероксидазой:2GSH + H2O2 → GSSG + 2H2OЕстьпредположение,чтоизменениесоотношенияGSH/GSSGвцитоплазме имеет значение и для митохондрий, поскольку в их мембранахнемало тиолсодержащих белков, в том числе и АТФ/АДФ-обменник,участвующих в образовании больших пор в мембране митохондрий, а значит, ив выходе цитохрома c в цитоплазму.Последствия окислительного стресса, в принципе, обратимы: перекисьводорода разлагается каталазой, регенерация тиоловых соединений можетосуществляться за счёт восстановления дисульфидов молекулами NADPH.Однако в присутствии Fe2+, образующегося в основном под действиемсупероксида, происходит образовании вторичных гидроксильных радикалов,20запускается цепное окисление липидов, в конечном счёте окисляются тиоловыегруппы АТФ/АДФ-порина, что ведёт к открыванию неселективных каналов.Начавшееся в результате присутствия Fe2+ перекисное окисление липидовусиливаетсяCa2+итормозитсявосстановленнойформойубихинона(убихинолом).В первую очередь окисляются ненасыщенные липиды, чаще всего поддействием свободных радикалов, в результате чего в мембране происходитобразование липидных гидроперекисей (поэтому процесс и называютперекисным окислением липидов, ПОЛ) (Рис.

3).Рис. 3. Перекисное окисление липидов [7].2.1.6 Действие продуктов ЛПО на мембраныПродукты ЛПО способны вызывать избирательную проницаемостьмембран для H+ и/или OH−, а также снижать электрическую стабильностьмодельных фосфолипидных мембран и мембран митохондрий.21При образовании гидроперекиси в мембранном белке возникает локальное«возмущение» упаковки, вызывающее активацию фосфолипазы и удалениеацильной цепи, несущей перекисную группу.

В случае, когда клетка всостоянии противостоять окислительной атаке на липиды, системы репарацииуспевают починить эти образующиеся дефектные зоны. Поскольку в первуюочередь окисляются полиненасыщенные жирнокислотные радикалы, а прирепарации к образованным молекулам лизофосфолипидов можно присоединятьразличные жирнокислотные радикалы, инициацию ПОЛ можно рассматриватькак способ изменения жирнокислотного состава мембранных липидов. Болеетого, инициация ПОЛ приводит к высвобождению из мембран арахидоновойкислоты, являющейся незаменимым субстратом для образования клеточныхрегуляторов (простагландинов, лейкотриенов, тромбоксанов).

Однако еслипроцесс ПОЛ выходит из-под контроля, образуются более стабильныепродукты, в числе которых — малоновый диальдегид (MDA), а такжекороткоцепочечные летучие углеводороды. Важно, что данный процесс можетпойтивместоβ-окисленияжирныхкислотврезультатенедостатканеобходимых ферментов [16].2.2 Структура комплекса цитохрома с с кардиолипином.Для полного пониманиянастоящей работы необходимо остановитсянепосредственно на ранних стадиях апоптоза и на описании комплексацитохрома c с кардиолипином, а именно на описании его строения и механизмапероксидазной активности.Перед непосредственным описанием комплекса Цит-КЛ необходимообратиться к общим сведениям по двум соединеним, входящим в его состав.2.2.1 Цитохром cЦитохром c представляет собой шаровидный гемопротеин из 94-114аминокислотных остатков, в зависимости от вида живого организма [51, 188].Целенаправленное изучение этого белка началось в первой трети XX века,когда была установлена его роль во внутриклеточном дыхании [103, 104].22Синтез апопротеина происходит в цитоплазме, после чего он доставляетсяв межмембранное пространство митохондрий, где происходит присоединениепростетической группы – железосодержащего гема [118].

Созреваниецитохрома c включают переходное осевое лигирование его гема с помощьюголо-цитохром-c-синтетазы.Рис. 4.«Воронкообразный последовательный» механизм фолдинга цитохрома c.Единицы фолдинга складываются в следующем порядке: синий (остатки 95, 96, 98 и99), зелёный (68 остатков), жёлтый (остатки 60 и 64), красный (остатки 74 и 75), исерые (остатки 43, 46 и 52), в итоге образуется нативный цитохром С (5). Шириналиний B, G, Y.

R пропорциональна количеству нефолдированных остатковаминокислот [80, 182]На ранних стадиях эволюции человекообразных цитохром c претерпелнекоторые изменения в своей первичной последовательности, и это нашло своёотражение в мутации в сайте связывания цитохрома c с цитохром c-оксидазой[80]. Однако в статье [36] говориться, что цитохром c – достаточноконсервативный белок, что во многом обусловлено мономорфностью его гена23[80, 118]: у абсолютного большинства видов идентичны аминокислоты: Cys14,Cys17, His18, Gly29, Pro30, Gly41, Asn52, Trp59, Tyr67, Leu68, Pro71, Pro76,Thr78, Met80 и Phe82 [80].В клетках человека цитохром c выполняет, по меньшей мере, четыресовершенно разные функции: 1) участвует в клеточном дыхании – переноситэлектроны во внутренней мембране митохондрий с дыхательного комплекса IIIна дыхательный комплекс IV; 2) окисленная форма цитохрома c способнаокислять супероксидный радикал с образованием молекулярного кислорода[19]:О2-● + Цит(Fe3+) → O2 + Цит(Fe2+).Эта реакция позволяет рассматривать окисленную форму цитохрома c вкачестве своего рода антиоксиданта, поскольку первичный свободный радикал,супероксид, превращается в молекулу кислорода; 3) апоптотическая роль вцитоплазме; 4) катализ реакции перекисного окисления липидов, котораяявляется причиной его выхода из митохондрий и запуска апоптоза.

Этоткатализ осуществляют молекулы цитохрома c, связанные с кардиолипином,входящим в состав внутренней мембраны митохондрий [19].При нейтральном рН гем в цитохроме c существует в низко-спиновойконфигурации (по данным электронного парамагнитного резонанса), ижелезный центр шестиугольно координирован пирролическими азотами изпорфиринового кольца и аксиальными лимандами Met80 и His18 апопротеина[80].Однако изменение физико-химических свойств клеточной среды, а такжеизменения в белковой части могут привести к конформационным изменениям,которые влияют на микроокружение гема [80].24Рис.

5. Структура цитохромаc. [80](а) Активный сайтчеловеческого цитохрома cварианта G41S, показаныосевые остатки Met80 и His18,тиоэфирно-связанные Cys14 иCys17, и Tyr67 образующийводородную связь с Fe-Sсвязанным Met80.(б) Трёхмерная структурачеловеческого цитохрома cварианта G41S. Наиболеегибкая петля, включающаяаминокислотные остатки 7085 окрашена в жёлтый цвет.Сайт распознавания для mАb1D3, содержащий остатки 4054, окрашен в сиреневый. Ω –обозначение петли.(с) Аминокислотный составэукариотических белков,принадлежащих цитохрому c.Цифры указывают позицииконсервативных остатковтирозина.

Высота каждогоостатка коррелирует с болеевысоким уровнемконсервативности уразличных видов. [100]Также необходимо обратить внимание на изменение вторичной структурыцитохрома с под действием метанола [63]. Эти изменения приводят кисчезновению полосы поглощения при 699 нм в результате разрывакоординационной связи гемового железа с атомом серы в Met80 [9], но приповторном помещении цитохрома в водный буфер его вторичная структуравосстанавливалась [63].2.2.2 КардиолипинКардиолипинявляетсяпредставителемглицерофосфолипидов.Онлокализован во внутренней мембране митохондрий. Впервые был выделен измиокарда. По своей химической структуре его можно рассматривать как25соединение, в котором 2 молекулы фосфатидной кислоты связаны с помощьюодной молекулы глицерина; кардиолипин является как бы «двойным»глицерофосфолипидом. Интересно, что он, в отличие от других фосфолипидов,обладает иммунными свойствами [6].Рис.

6. Общая формула кардиолипина: R1, R2, R3, R4 – радикалы высших жирныхкислот [6].Среди функций кардиолипина необходимо отметить белковый транспорти создание условий для ионной проницаемости [85, 111]. Кардиолипин играетбольшую роль в функционировании дыхательной цепи митохондрий. Показано,что для нормальной работы комплекса III и цитохромоксидазы необходимо ихсвязывание с определённым количеством молекул кардиолипина [75]. Наличие4 сайтов связывания с кардиолипином у АТФ-синтазы было показано ещё в1990 году [66].

Предполагается, что кардиолипин несёт роль протоннойловушки, локализуя поток протонов и минимизируя таким образом измененияpH в межмембранном пространстве, эта функция – следствие структурыкардиолипина: захватывая протон, он образует бициклическую структуру,которая несёт отрицательный заря и может освобождать или связывать протоныдля поддержания pH [78].Если говорить непосредственно об апоптозе, то исследования последних20 лет показывают наличие особого фермента – кардиолипин-специфичнойоксигеназы, катализирующей образование гидроперекиси кардиолипина, чтоведёт за собой конформационные изменения последнего и как следствие –26перемещение кардиолипина на внешнюю мембрану митохондрии, чтоспособствует образованию поры [93], через которую и выходит в цитозольцитохром c.