Диссертация (Регенеративные и протекторные эффекты экзогенного пероксиредоксина 6 и паракринных факторов мезенхимальных стволовых клеток при химических и механических травмах кожи), страница 10

Хондрогенная дифференцировка (с добавлением 10% эмбриональнойтелячьей сыворотки, 100 мкМ дексаметазона и 0,1 мкг / мл TGF-β), былаподтвержденасиспользованиемокраскиальциановымголубым.Адипогенная дифференцировка (с добавлением 10% эмбриональной телячьейсыворотки, 10 мкМ дексаметазон, 10 мкг/мл инсулина, и 100 мкг/мл IBMX)была подтверждена окрашиванием с использованием Oil Red-O.После получения клеточного монослоя проводили полную сменукультуральной среды и через 3 суток кондиционированную культуральнуюсреду объединяли с лизатом МСК.

Клетки разрушали, используя методзамораживания-оттаивания. Содержание белка в кондиционированной средеМСК составила 10,0±0,3 мг/мл. Пероксидазные удельные активности – 40мкм/мг/мин по Н2О2 и 25 мкм/мг/мин по трет-бутил гидропероксиду.Получение кондиционированной среды МСКПосле получения клеточного монослоя проводили полную сменукультуральной среды и через 3 суток кондиционированную культуральнуюсреду(кМСК)объединялислизатомМСК,которыеиспльзовали57непосредственно в экспериментах. Клетки разрушали, используя методзамораживания-оттаивания.Полученныйпрепаратсмешиваливстерильныхусловияхсметилцеллюлозой для получения стерильного геля.2.

Методы2.1. Модель ожога трихлоруксусной кислотойПосле депиляции паравертебральной области спины, создаваликонтактный ожог II-IIIa степени, который сопровождается повреждениемэпидермиса и подлежащего слоя с сохранением сальных и потовых желёз(данный ожог не требует хирургического вмешательства, например,пересадки кожи). Контактный ожог осуществляли пропитанной в 50%трихлоруксуснойкислотефильтровальнойбумагой.Площадьожогасоставляла 10×10 мм2 (рис. 8А).

Время экспозиции пропитанной бумагисоставило 3 минуты, после чего место нанесения ожога промывалосьпроточной водой 15 секунд.АБРис. 8. Модель химического ожога ТХУ58Посленанесенияожогачерез2часавдепилированнуюпаравертебральную область спины внутрикожно были введены препараты(300 мкл, 10 введений по 30 мкл), площадь обкалывания 15×15 мм2.Подопытных животных разделили на контрольную и 3-и опытные группы взависимости от исследуемого препарата (рис.8Б).Вконтрольнойгруппе,вобластьвокругранывводилифизиологический раствор (300 мкл).

1-й группе - Prx 6 (2 мг/мл, 300 мкл). Во2-й группе - кондиционированная среда МСК (раствор, 10мг/мл, 300мкл). В3-й группе –кМСК (10 мг/мл, 150 мкл) + Prx 6 (4 мг/мл, 150 мкл).2.1. Модель механической полнослойной кожной раныМоделирование раневого процесса кожи предусматривало иссечениеполнослойного кожного лоскута до фасции (диаметр 10 мм) в свободной отшерсти межлопаточной области (рис.7).

Так же производилось вшивание подкожуинтактнойобластипластиковогокольцадляпредотвращенияконтракции краевого эпителия, которое помещалось между фасцией икожным лоскутом [Galiano R.D. et al., 2004; Heidari F. et al., 2016; Du H.C. etal., 2017; Lee J.W. and Song K.Y., 2018]. Кольцо было извлечено на 14-е суткиэксперимента.Подопытных животных разделили на контрольную и 3-и опытныегруппывзависимостиотисследуемогораневогопрепарата.Дляпредотвращения бактериального заражения в ранах во всех группах висследуемые растворы был добавлен антибиотик гентамицин (1 мг/мл).

Вконтрольной группе, на рану капали физиологический раствор (200 мкл). 1-йгруппе - Prx 6 (1 мг/мл, 200 мкл). В 2-й группе на рану наносилиметилцеллюлозный гидрофильный гель, содержащий кондиционированнуюсреду (кМСК) 200мкл. В 3-й группе – гель с кМСК (100 мкл) + Prx 6 (1 мг/мл,100 мкл).59Рис. 7. Модель раневого дефекта (механическая рана)Далее, во всех четырех группах, поверх препарата, накладываливырезанную по форме раны коллагеновую пленку и закрывали трубкурезиновой пробкой для предотвращения механического загрязнения раны.Нанесение препаратов производилось ежедневно в течение 14 сутокпосле нанесения травмы (до снятия кольца).2.3.

Планиметрические методы исследованияВосстановление целостности кожного покрова определяется срокамизаживления раны, что связано со скорость течения фаз раневого процесса.Скорость заживления представляет собой величину, характеризующуюизменениеплощадипланиметрическогоранызаисследованияединицувремени.осуществлялосьпоПроведениефотографиямэкспериментальных ран в масштабе 1:1. Количественные исследованияпроводили с помощью программы Image Tool for Windows, v. 3.0(«UTHSCSA», США).602.4.

Приготовление парафиновых срезовДля проведения морфологических исследований вывод животных изэксперимента осуществляли на 3, 7, 10-есутки методом декапитации.Производили полное иссечение раны с захватом интактных тканей.Полученный материал фиксировали в фиксаторе Myrsky’s Fixative («Merck»,USA) 24 часа, промывали проточной водой и отмывали в PBS.Затем образцы для обезвоживания проводили через батарею растворовэтилового спирта (70% – 2 раза, 80%, 96%, 100% – 2 раза; в течение 1 часа)при t = 37ºC в термостате. После образцы проводили через смесь этиловыйспирт – ксилол (в соотношении 1:1), ксилол (2 раза) в течение 1 часа при t =37ºC в термостате.

Затем через смесь ксилол – парафин (в соотношении 1:1),парафин (2 раза) в течение 1 часа при t = 56ºC в термостате, после чегозаливали в парафин в специальные формочки.Полученныеблокирезалинамикротоме(«ThermoElectronCorparation», USA), толщина срезов 10 мкм. Далее образцы помещали настекласадгезивнымпокрытиемHistoBond(«MarienfeldLaboratoryGlassware», Germany), расправляли на термостолике OTS 40 («SMT»,Germany) при t = 42ºС и высушивали в термостате при t = 37ºC в течение 1часа (для надежной фиксации на стеклах).Депарафинизация срезов: стекла с фиксированными срезами проводиличерез ксилол (2 раза), этиловый спирт – ксилол, этиловый спирт (100% – 2раза, 96%, 70%), дистиллированная вода.2.5. Гистологический анализСрезы окрашивали гематоксилин-эозином (Hematoxylin-Eozin accordingto Ehrlich, «Fluka», USA), просветляли и заключали в смолу Histofluid(«Marienfeld Laboratory Glassware», Germany), затем накрывали покровнымистеклами («Menzel-Glaser», Germany).Микроскопический анализ проводили на микроскопе Leica DM 6000,фотографии получали с помощью цифровой камеры для микроскопии Leica61DFC 490.

Количественные исследования проводили с помощью программыImage Tool for Windows, v. 3.0 («UTHSCSA», США).2.6. Иммуногистохимический анализДля ИГХ-исследований использовались парафиновые срезы толщиной10 мкм, полученные стандартным методом. В качестве первичных антителиспользовались моноклональные антитела против Ki–67, в качествевторичных антител – антикроличий конъюгат с щелочной фосфотазой. ДляправильнойпостановкиИГХреакцийставилиположительныеиотрицательные контроли. В качестве отрицательных контролей бралиобразцы исследуемых срезов, которые подвергались стандартной процедуреиммуногистохимической реакции, но без добавления первичных антител.Положительные контроли для каждого антитела выбирали в соответствии соспецификациямиотфирмы-производителя.Микроскопическийанализпроводили на микроскопе Leica DM 6000, фотографии получали с помощьюцифровой камеры для микроскопии Leica DFC 490.2.7.

Иммуноферментный анализЦитокины определяли через 24 часа после нанесения ожога. Кусочкиткани раны замораживали при t=-40° С. В день определения активноститканьразмораживалиигомогенизировали(фенилметилсульфонилфторид),0.2мМ.наЗатемхолодевPMSFгомогенатытканейцентрифугировали при 40° С и 14 000 об/мин 15 минут. В надосадочнойжидкости проводили стандартный иммуноферментный анализ (ИФА).Образцы сорбировали на 96-луночный планшет в течение 1 часа при 370С.ПослечетырехкратногопромыванияPBS,блокировалисайтынеспецифического связывания 2% фетальной сывороткой, разведённой в PBSв течение 30 мин при 370С. Затем в лунки вносили кроличьи антитела к IL-1,IL-8, IL-10, Cas3 и Ki-67, а также мышиные антитела к интерлейкину 6 (IL 6)с разведением 1:500 в 2% растворе фетальной сыворотки в PBS.

Планшет с62первичными антителами оставляли на ночь при температуре +4 о С. Затемлунки промывали фосфатным буфером и наносили раствор антител киммуноглобулинам мыши и кролика, конъюгированных с пероксидазойхрена в разведении 1:1000 и инкубировали в термостате при 370С в течениетрёх часов. Планшет промывали, связавшиеся антитела детектировали спомощью субстрата для пероксидазы хрена – ABTC (2,2’-азинобис(3этилбензиазолин-6-сульфоноваякислота)),растворённоговцитратно-фосфатном буфере с добавлением перекиси водорода. Затем измерялиоптическую плотность на мультискане при 450 нм (Labsystems MultiskanPlus, Финляндия). Концентрацию интерлейкинов, Cas 3 и Ki-67 рассчитывалина мг белка.

Концентрацию белка в ткани определяли методом Бредфорда.2.8. Измерение концентрации оксида азота в сыворотке кровиПродукциюNOвповрежденнойкожекрысыизмерялипоконцентрации нитритов, являющихся конечным продуктом метаболизмакороткоживущего соединения NO. Количество нитритов измеряли сиспользованием реактива Грисса, содержащего 0,1% раствора N-нафтилэтилендиамин дигидрохлорида в 2,5% растворе фосфорной кислоты и 1%раствора сульфаниламида в 2.5% фосфорной кислоты в соотношении 1:1.Кусочки ткани размораживали и гомогенизировали на холоде в PMS, 0.2 мМ.Затем гомогенаты тканей центрифугировали при 40°С и 14 000 об/мин 15минут.

Образец надосадочной жидкости помещали в 96-луночный планшет(100 мкл на лунку), добавляли 100 мкл свежеприготовленного реактиваГрисса и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Оптическуюплотность измеряли на приборе Multiscan (Labsystem Plus, Финляндия) придлине волны 546 нм.2.9. Определение малонового диальдегидаПредварительно замороженную в кельвинаторе (-80˚С) ткань (кожу)размалывали до пылеобразного состояния (с использованием жидкого азота).63К 100 мг образца добавляли 3 мл 1% H3PO4 и 1 мл 0,8% водного растворатиобарбитуровой кислоты (ТБК), нагревали смесь на кипящей водяной бане втечение 45 мин.

После охлаждения добавляли 4 мл н-бутанола и отделялислой бутанола путем центрифугирования. Оптическую плотность определялипри длине волны 535 нм относительно контроля без добавления ткани.2.10. Биохимический анализ кровиВзятие образцов крови для биохимического анализа проводили через24 часа после нанесения ожога. Взятие крови производилось послевыведения животного из эксперимента методом декапитации. Полученныйбиологический материал центрифугировали в течение 5 минут, 14000об./мин., для проведения биохимического теста отбирали сыворотку крови(30мкл), помещали на специализированные тест-полоски с соответствующеймаркировкой (Тест-полоски Рефлотрон®-плюс, «Roche», USA).Биохимический анализ проводили на биохимическом экспрессанализаторе Reflotron Plus («Roche Diagnostics», Switz.) в течение 2 минут.Измерялиактивностьаланинаминотрансферазы(АЛТ)иаспартатаминотрансферазы (АСТ).2.11. Статистический анализСтатистический анализ выполняли с использованием программыMicrosoftExcel2010.Послепроверкивыборкинанормальностьраспределения вычислялась средняя арифметическая величина (М) истандартное отклонение средней арифметической (m).