Диссертация (Регенеративные и протекторные эффекты экзогенного пероксиредоксина 6 и паракринных факторов мезенхимальных стволовых клеток при химических и механических травмах кожи), страница 11

Данные выражали какM±m с указанием количества экспериментов (N). Проверка достоверностиразличийосуществляласьпокритериюСтьюдента(t-критерий).Математическая обработка морфометрических данных гистологическихсрезов проводилась с использованием метода непараметрической статистики(U-критерий Манна-Уитни для малых выборок).64III РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ1. Химический ожог кожи, вызванный трихлоруксусной кислотой1.1.

Динамика регенерации химического ожога кожи (безиспользования каких-либо препаратов)В данной работе был исследован химический ожог II и IIIа степени,который сопровождается повреждением эпидермиса и подлежащего слоя ссохранением сальных и потовых желёз (данный ожог не требуетхирургическоговмешательства,например,пересадкикожи).Оценкудинамики регенерации ожоговой раны производили на 1, 3, 7, 10, 14 и 21сутки. Полное закрытие ожоговой раны наблюдалось на 20-24 сутки.1.1.1. Морфология раневого процесса при химическом ожогеВизуальная оценка состояния зоны химического ожога у животногопоказала, чтопервые сутки наблюдается отделение пораженного слояэпидермиса, визуально ожог в течение 24 часов практически не изменяется.Так как ожог был сделан трихлоруксусной кислотой, которая на местеконтактастканямивызываетденатурациюбелковсразвитиемкоагуляционного некроза и обезвоживания тканей, в третьи сутки, на местеожога сформировался плотный, темный, поверхностный струп, при которомнекроз не распространяется вглубь.

Степень оволосенения зависит отвозраста экспериментальных животных. Так, у более молодых особей ростволос происходит намного быстрее, чем у более взрослых. К десятым суткамв контрольной группе наблюдается частичное отшелушивание струпа (рис.9),к двадцать первым суткам практически полная эпителизация (Таблица 1).65Рис. 9. Динамика заживления химического ожогаA – 3 сутки; Б – 7 сутки; В – 10 сутки; Г – 14 сутки; Д – 21 суткиТаблица 1Динамика изменения площади ожоговой раны (M ± m, мм2)время, сутки 12площ, мм92,1±17,435791012142191,7±12,089,3±9,788,8±10,180,6±9,964,9±14,449,5±18,327,1±9,06,3±2,1Через 24 часа в ожоговой ране наблюдается язвенный дефект (рис.10А). Дно пораженной ткани представлено молодой грануляционной тканьюс микроабсцессами, очагами некроза и явлениями отека.На 3 сутки после нанесения ожоговой раны на дне раны наблюдаетсядиффузно-очаговая макрофагальная инфильтрация с очагами некроза иформированиеммолодойгрануляционнойткани.Поверхностьраныпредставлена струпом (рис.

10Б).На 10 сутки после нанесения ожога (рис. 10В) дно поверхностногоязвенного дефекта представлено молодой фиброзной тканью с диффузноочаговой лимфоцитарной инфильтрацией, на которую наползает с краевновообразованный эпидермис.На 21 сутки (рис. 10Г) эпителизация полностью завершена, эпидермиспокрыт роговым слоем.66Рис.10.Морфологическаякартинадинамикизаживленияожоговой раныA – 1 сутки после ожога; Б – 3 сутки; В - 10 сутки; Г - 21 сутки.Окраска гематоксилином и эозином. ×200, N=151.1.2.

Уровень клеточного апоптоза в ожоговой ранеКаспазы играют важную роль в процессах апоптоза, некроза ивоспалительных процессах. При стрессовых условиях и воздействии наклетку повреждающих веществ активируется процесс контролируемойклеточной гибели – апоптоз. Результатом апоптоза является постепенное имедленное избавление от «ненужных» в функциональном отношении наданный момент клеток, например, с серьезными нарушениями структуры илифункции генетического аппарата. Когда же на клетку оказывают воздействияповреждающие факторы в чрезмерных дозах, апоптоз переходит в стадиюнеконтролируемой клеточной гибели, т.

е. некроз. Так, вследствие,химического ожога сначала в ткани происходит процесс энергозависимого67апоптоза, когда же концентрация повреждающего химического агентавоздействующего на ткань увеличивается, и количество разрушенных клетокначинает превышать количество пролиферирующих, происходит нарушениегоместостаза клеточных популяций и в организме наступает стадия некроза.Так как каспаза 3 (Cas 3) является ключевой эффекторной каспазой, впроцессе апоптоза, её можно использовать в качестве основного маркераклеточной гибели.Концентрация, нг/мгбелка12*10**1 сут3 сут86420здороваякожа1 час7 сутРис.

11. Концентрация Cas 3 в пораженной коже в разные срокипосле нанесения химического ожога*- достоверно по отношению к контролю (здоровая кожа) (р<0,05), N=15В данной работе показано (рис. 11), что концентрация Cas 3 через 1 часпосле нанесения ожоговой раны в 2,3 раза выше, чем в здоровой коже исоставляет 10,9±0,3 нг/мг белка. Через 24 часа (1 сутки) после нанесенияожога концентрация Cas 3 составляет 8,2±0,4 нг/мг белка и к третьим суткампадает незначительно.

Через неделю после нанесения ожога концентрацияCas 3 в ожоговой ране падает до уровня достоверно незначимогоотносительно концентрации Cas 3 здоровой кожи крысы.1.1.3. Уровень клеточной пролиферации в ожоговой ранеУниверсальным маркером для оценки клеточного цикла являетсяядерный белок – антиген Ki-67, по экспрессии которого можно исследовать68пролиферативную активность клеток. Ki-67 – белок, который синтезируетсяв ядрах только тех клеток, которые находятся в процессе деления.Концентрация, нг/мгбелка12*10**3 сут7 сут*86420здороваякожа1 час1 сутРис. 12.

Концентрация Ki-67 в ожоговой ране в разные сроки посленанесения химического ожога*- достоверно по отношению к контролю (здоровая кожа) (р<0,05), N=15Концентрация Ki-67 в здоровой коже (рис.12) составляет 6,3±0,2 нг/мгбелка. Через 1 час после нанесения ожоговой раны уровень Ki-67повышается и становится равен 8,3±0,4 нг/мг белка, а через 24 часа - 10,3±0,1нг/мг белка, что в 1,6 раз больше, чем в здоровой коже. К третьим и седьмымсуткам концентрация маркера пролиферации незначительно падает исоставляет 9,3±0,5 нг/мг белка и 9,3±0,3 нг/мг белка соответственно.1.1.4. Степень окислительного стресса в ожоговой ранеМалоновыйдиальдегид(МДА)—одинизпродуктовсвободнорадикального окисления липидов, накопление которого отражаетстепень окислительного стресса в организме.

Оценка этого показателянеобходимадляопределенияпатологического процесса.динамикиразвитиятогоилииного69Концентрация, нмоль/г180*160140120100*806040200здороваякожа1 час1 сут3 сутРис.13. Концентрация малонового диальдегида в пораженной кожев разные сроки после нанесения химического ожога*- достоверно по отношению к контролю (здоровая кожа) (р<0,05), N=15Исследование показало (рис. 13), что концентрация МДА в здоровойкоже крысы находится на уровне 59,3±6,0 нмоль/г ткани. Через 1 час посленанесения ожога концентрация МДА в коже возросла в 2,5 раза и составила145,4±7,8 нмоль/г.

Через сутки концентрация в ожоговой ране уменьшилась исоставила 76,6±4,6 нмоль/г. На третьи сутки концентрация МДА в ранесоставляла 74,5±8,9 нмоль/г, что статистически незначимо по сравнению создоровой кожей крысы.Таким образом, химический ожог на первом этапе сопровождаетсямощным окислительным стрессом, который, по-видимому, увеличиваеттяжесть поражения ткани и, соответственно, приводит к увеличению сроковзаживления раны [Soneja, A. et al., 2005].1.1.5. Интерлейкиновый профиль ожоговой раныВ результате ожога в пораженной области возникает процессвоспаления, при котором белки плазмы и лейкоциты крови переходят измикроциркуляторных сосудов в очаг воспаления.

Ход воспалительногопроцесса управляется медиаторами воспаления – эндогенными веществами,70которые появляются в очаге воспаления. Одним из важнейших медиатороввоспаленияявляетсяIL-6.Онпродуцируетсяфибробластами,активированными моноцитами, нейтрофилами и макрофагами. Уровень ИL6коррелирует с глубиной поражения площадью ожога. Иммунологическоедействие IL-6 включает увеличение В-клеточной пролиферации и продукциииммуноглобулинов [Kita M.

et al., 1992]. Синтез IL-6 повышается подвлиянием IL-1. В свою очередь, IL-6 тормозит образование IL-1. IL-1 и IL-3запускают синтез IL-8, основная функция которого выступать в качествехемоаттрактанта, т. е. обеспечивать хемотаксис в зону воспаления различныхтиповклеток:нейтрофилов,моноцитов,эозинофилов,Т-клетокилимфоцитов. IL-8 способен вызывать миграцию клеток участвующих ввоспалении и способствовать их адгезии делают его активным участникомострой воспалительной реакции в местах поражения ткани.Кроме цитокинов, стимулирующих воспаление, существуют цитокины,действующие в противовоспалительном направлении. В качестве такогоцитокина выступает IL-10.