Диссертация (Регенеративные и протекторные эффекты экзогенного пероксиредоксина 6 и паракринных факторов мезенхимальных стволовых клеток при химических и механических травмах кожи), страница 12

Секреция этого цитокина не позволяетвоспалению приобрести неконтролируемый характер. IL-10 продуцируетсяТ-клетками,моноцитами,противовоспалительныймакрофагамицитокин,IL-10иВ-клетками.угнетаетКакпродукциюпровоспалительных цитокинов IL-1, IL-6, IL-8. IL-10, в присутствии IL-3 иIL-4,можетоказыватьиммуностимулирующиеэффектычерезинициализацию роста тучных клеток и других клеток-предшественников. Вто же время IL10 усиливает пролиферацию В-клеток, защищает их отапоптоза, повышает синтез IgM и IgA, стимулирует IgE.Таким образом, проанализировав цитокиновый профиль химическогоожога кожи можно сделать вывод об интенсивности процессов воспаления изаживления в поврежденной ткани и проследить динамику регенерацииткани в целом.71Концентрация, нг/мг белка14**12** *10* **здоровая кожа****1 час после нанесенияожоговой раны8* *61 сут после нанесенияожоговой раны43 сут после нанесенияожоговой раны27 сут после нанесенияожоговой раны0IL-1IL-6IL-8IL-10Рис.

14. Концентрация цитокинов в ожоговой ране в разные срокипосле нанесения ожоговой раны*- достоверно по отношению к контролю (здоровая кожа) (р<0,05), N=15Концентрация провоспалительных цитокинов (рис. 14) в здоровой кожеIL-1, IL-6 и IL-10 равен 7,4±0,2; 5,8±0,3 и 7,7±0,4 нг/мг белка соответственно.Через один час после нанесения ожога уровень провоспалительныхцитокинов увеличивается в 1,5-2 раза: IL-1 в 1,4 раза (10,4±0,3 нг/мг белка);IL-6 в 1,9 раз (10,8±0,6 нг/мг белка); IL-8 в 1,7 раз (12,9 ±0,5 нг/мг белка).Далее уровень провосполительных цитокинов уменьшается.

В первые суткипосле ожога уровень IL-1 равен 10,1±0,2 нг/мг белка; IL-6 – 9,9±0,3 нг/мгбелка; IL-8 – 11,2±0,5 нг/мг белка. В третьи сутки: IL-1 – 9,3±0,3 нг/мг белка;IL-6 – 8,9±0,3 нг/мг белка; IL-8 – 11,1±0,3 нг/мг белка. На седьмые сутки: IL1 – 8,8±0,3 нг/мг белка; IL-6 – 6,1±0,4 нг/мг белка; IL-8 – 9,4±0,2 нг/мг белка.КонцентрацияпротивовоспалительногоцитокинаIL-10вкожездоровой крысы составляет 4,6±0,1 нг/мг белка. В первые сутки после ожогауровень IL-10 возрастает в 2,1 раза и составляет 9,7±0,3 нг/мг белка. Далееуровень противовоспалительного цитокина резко снижается и составляет в72первые сутки после нанесения ожога 6,1±0,2 нг/мг белка; в третьи сутки5,8±0,2 нг/мг белка; на седьмые сутки 4,8±0,3 нг/мг белка.Концентрация IL-6 и IL-10 значительно увеличивается в первый часпосле нанесения ожоговой травмы, через неделю после нанесенияхимическогоожогасоответствуетздоровойкоже,чтоговоритобуменьшении интенсивности процесса воспаления.1.1.6.

Уровень оксида азота в ожоговой ранеОксид азота (NO) —эффективный регулятор систем кровообращения ворганизме человека на всех его уровнях, от центральной системы домикроциркуляции в кожных тканях. Низкий уровень конституциональнойгенерации NO играет роль оптимального регулятора и поддерживаетКонцентрация, %(относительные значения)близкую к физиологической норме скорость микроциркуляции.300*250*200150100500здоровая кожа1 час1 сут3 сутРис. 15. Концентрация оксида азота в пораженной коже в разныесроки после нанесения химического ожогаДанные выпажены в процентах (среднее значение) относительно контроля(здоровая кожа) ± SE (стандартная ошибка).

N=15. Контроль принят за 100%.*- достоверно по отношению к контролю (р<0,05)73ВкожеNOактивноучаствуетвсинтезеколлагена.Привоспалительных процессах в коже, воздействии УФ, инфекциях или приповреждениях кожи происходит интенсивное выделение NO и его генерацияпревышает нормальный функциональный уровень.В нашем исследовании было показано (рис.

15), что концентрацияоксида азота через 1 час после нанесения химического ожога увеличиваетсяна 85,3%, относительно здоровой кожи. Через сутки после нанесения ожогауровень оксида азота в ране увеличивается еще на 62,5%, что на 147,8% (в 2,5раза) выше, чем в здоровой коже. К третьим суткам уровень оксида азота вране понизился и достоверно не отличался от здоровой кожи здоровой коже.Поскольку резкое повышение уровня оксида азота свидетельствует овоспалительном процессе, можно сделать вывод о том, что пик фазывоспаления в разы происходит в первые сутки после нанесения ожоговойраны. Далее, уровень оксида азота в ране снижается.1.1.7.

Биохимические показатели крови при химическом ожогеДля получения более информативной картины общего состоянияорганизма после химического ожога, были получены результаты активностицитолитических ферментов АЛТ и АСТ в сыворотке крови. Известно, чтоповышение концентраций АЛТ и АСТ в крови может происходить врезультатеразличныхповрежденийтканей,приводящихквоспалению и некрозу клеток, в том числе и при химических ожогах.острому74AСT350AЛТ300*7060250*200150*50U/LU/L80*403010020501000здороваякожаожог 1 сутожог 3 сутздороваякожаожог 1 сутожог 3 сутРис. 16. Активность ферментов AСT и AЛT в сыворотке кровикрысы после нанесения химического ожога кожи*- достоверно по отношению к контролю (здоровая кожа) (р<0,05), N=15Экспериментально было показано (рис.16), что ферментативнаяактивность АЛТ и АСТ в крови здоровой крысы составляет 29±5 U/L и 115±8U/L соответственно.

В первые сутки после нанесения химического ожогаактивность АЛТ увеличивается в 2,3 раза и составляет 66±8 U/L, активностьАСТ увеличивается в 2,4 раза и составляет 280±21 U/L. К третьим суткамферментативная активность АЛТ и АСТ в крови падает и составляет 46±3U/L и 186±13 U/L соответственно.751.2. Влияние экзогенного пероксиредоксина 6 (Prx6) ипаракринных факторов МСК (кМСК) на динамику заживленияхимического ожога кожиВ данной модели исследуемые препараты вводились внутрикожно вприлегающий к ожогу участок здоровой кожи, поскольку образованиедостаточно твёрдого струпа при ожоге препятствует проникновению в кожуи под кожу лекарственных веществ.1.2.1.

Влияние Prx6 и кМСК на морфологию ожоговой раныОценка состояния зоны химического ожога показала, что в первые итретьи сутки визуальное и морфологическое различие от использованияразличныхпрепаратовпосравнениюсконтрольнойгруппой(физиологический раствор) не наблюдается. К десятым суткам в контрольнойгруппе наблюдается частичное отшелушивание струпа (рис.17), однакопроцесс регенерации протекает достаточно медленно.

В группах с введениемисследуемых препаратов наблюдается практически полное очищениеожоговой раны от струпа (табл.2).Рис. 17. Внешний вид ожоговой раны на 10 сутки прииспользовании Prx 6 и кМСКА –физ. р-р (контроль); Б – Prx 6, В –кМСК, Г – Prx 6 + кМСК76Таблица 2Динамика изменения площади ожоговой раны (M ± m, мм2)Сутки посленанесенияожогаКонтроль(физ.Prx 6раствор)(группа 1)Prx6+факторыфакторыМСК(группа 2)МСК(группа 3)393,4±4,094,2±3,995,8±4,195,1±2,5491,6±4,788,9±3,289,3±2,990,7±3,7588,8±6,586,2±5,285,4±3,684,6±4,8688,0±6,980,8±5,982,5±5,180,1±6,7785,8±8,672,6±7,179,8±5,971,3±7,5885,1±8,857,1±7,7*x77,9±6,8#ǂ55,8±9,1*x983,8±7,146,1±8,9*x69,7±7,5*ǂ39,7±8,9*x1081,6±7,638,6±7,1*x66,8±9,7*xǂ34,3±9,5*x* – достоверно по сравнению с контролем, р < 0,05.#– достоверно по сравнению с группой 1, р < 0,05.х – достоверно по сравнению с группой 2, р < 0,05.ǂ – достоверно по сравнению с группой 3; р < 0,05.В группе с применением физиологического раствора (рис.

18А) дноповерхностногоязвенногодефектаподрытоипредставленомолодойфиброзной тканью с диффузно-очаговой лимфоцитарной инфильтрацией, накоторую наползает с краев новообразованный эпидермис. В прилежащихучастках резкие новообразованные волосяные фолликулы с пролиферациейлипоцитов в шеечных отделах.В группе с применением Prx 6 (рис. 18Б) дно поверхностногоязвенного дефекта подрыто наползающим эпидермисом. В дне молодаяфиброзная ткань, инфильтрированная лимфоцитами с примесью макрофагов. Вприлежащихучасткахнаблюдаетсяновообразованиеволосяных фолликулов с пролиферацией липоцитов.немногочисленных77Рис.

18. Морфологическая картина состояния ожоговой раны на 10сутки при использовании Prx 6 и кМСКА – физ. раствор (контроль), Б – Prx 6, В –кМСК, Г – Prx 6 + кМСКОкраска гематоксилином и эозином. ×200, N=15Использование паракринных факторов мезенхимальных стволовыхклеток показало (рис. 18В), что дно язвенного дефекта эпидермизировано, сроговым слоем. Под эпидермисом наблюдается узкий слой фиброзной ткани,инфильтрированный лимфоцитами, волосяных фолликулов достаточно много.При совместном использовании Prx 6 и паракринных факторов МСК(рис.

18Г) дно язвы не прослеживается. Поверхность препарата на всемпротяженииэпителизирована,эпидермиспокрытроговымслоем.Субэпителиальные участки дермы в виде узкой полоски склерозированы.Волосяных фолликулов много (существенно больше, чем контроле и сприменением препаратов по отдельности). В шеечных отделах фолликуловнаблюдается пролиферация липоцитов.781.2.2. Влияние Prx6 и кМСК на уровень апоптоза в ожоговой ранеВ анализе на наличие фермента Cas 3, индуцирующего процессыапоптоза (рис.

19), было отмечено, что в группах, где после ожогаиспользовались препараты пероксиредоксина 6 и паракринных факторовМСК, относительная концентрация Cas 3 была ниже, по сравнению сгруппой, где использовался физиологический раствор более, чем в 2 раза ибыл достоверно значим уровню Cas 3 в здоровой коже.Концентрация,%(относительные значения)250200*150100500ЗдороваяФиз.растворPrx 6кMCKPrx 6+кMCKРис. 19. Концентрация Cas 3 в ожоговой ране при использованииPrx 6 и кМСКОтносительная концентрация Cas 3 в ране через 24 часа после нанесения ожога ТХУ.Данные рассчитаны относительно контроля (здоровая кожа) ± SE (стандартная ошибка).N=15.

Контроль принят за 100%.*- достоверно по отношению к контролю (р<0,05)Из этого можно сделать вывод, что препараты с Prx 6 и факторами МСКуменьшают содержание Cas 3 в клетках поражённой ткани, что означаетснижение уровня апоптоза.Кроме того, можно отметить, что наименьшее количество Cas 3содержится в коже животных, в которыой присутствуетфермент-антиоксидант Prx6.экзогенный791.2.3. Влияние Prx6 и кМСК на уровень пролиферации в ожоговойранеСравнивая эффект применения препаратов на основе ферментаантиоксиданта Prx 6, паракринных факторов МСК, а также совместногоприменения двух препаратов при химическом ожоге кожи, заметим, что вовсех трех группах наблюдается повышение концентрации Ki-67 в 2 раза,относительно группы с применением физиологического раствора (рис. 20).Концентрация,%(относительные значения)350***Prx 6кMCKPrx 6+кMCK300250200*150100500Здоровая Физ.растворРис.

20. Концентрация Ki-67 в ожоговой ране при использованииPrx 6 и кМСКОтносительная концентрация Ki-67 в ране через 24 часа после нанесения ожогаТХУ. Данные рассчитаны относительно контроля (здоровая кожа) ± SE (стандартнаяошибка). N=15. Контроль принят за 100%.*- достоверно по отношению к контролю (р<0,05)По иммуногистохимическому анализу на выявление Ki-67 можносделать выводы о пролиферативной активности клеток эпидермиса и дермыкожи на третьи сутки после ожога. Так как наличие Ki-67 в клетках тканисвидетельствует об интенсивности пролиферации, в тканях, где наблюдаетсяповышенная экспрессия Ki-67, присутствует интенсивная синяя окраска,окрашивающая клетки, находящиеся в фазе деления.Результаты иммуноферментного анализа подтверждаются даннымииммуногистохимического анализа на маркер клеточной пролиферации Ki-67(рис.21).80Рис.