Диссертация (Регенеративные и протекторные эффекты экзогенного пероксиредоксина 6 и паракринных факторов мезенхимальных стволовых клеток при химических и механических травмах кожи), страница 13

21. Распределение Ki-67 в ожоговой ранеИммуногистохимическое окрашивание с антителами к Ki-67 в ране через 24 часапосле нанесения ожога ТХУ. х200А – физ. раствор (контроль), Б – Prx 6, В –кМСК, Г – Prx 6 + кМСКОбласти интенсивного иммунного сигнала отмечены стрелками.В контрольной группе (рис. 21А) синяя окраска наблюдается в областиволосяных фолликулов, где большинство клеток наружного и внутреннегокорневых эпителиальных влагалищ волосяных фолликулов проявлялислабую реакцию на наличие Ki-67 - позитивных клеток, что свидетельствуетоб их нахождении в состоянии замедленной пролиферации.

Напротив, вгруппах, где использовались помогающие заживлению ожога препараты,отмечается повышение интенсивности окраски не только клеток волосяногофолликула, но и клеток базального и шиповатого слоев эпидермиса кожи.Наибольшую пролиферативную активность проявляют клетки кожи в группе,где использовался препарат Prx 6 с факторами МСК.

В этой группе в81состоянии активного деления кроме клеток волосяного фолликула находятсятакже клетки верхнего слоя дермы и клетки базального и шиповатого слоёвэпидермиса, где идёт активная пролиферация кератиноцитов и нарастаниеэпителия. За счёт высокой пролиферации клеток эпидермиса в данной группеобластьнарастанияэпителиальногоклина(регенерата)больше,посравнению с другими группами.В группе с Prx 6 (рис. 21Б) также наблюдается повышениеинтенсивности пролиферации эпителиальных клеток влагалищ волосяныхфолликулов, по сравнению с контрольной группой.

В области эпидермиса идермы отмечается равномерное распределение делящихся клеток, особыелокации с активно пролиферирующими клетками выделить нельзя. Областьнарастания эпидермиса выражена слабо.В группе с факторами МСК (рис. 21В, 21Г) реакция на наличие Ki-67 позитивных клеток активно выражена также в областях волосяныхфолликулов, также можно отметить наличие пролиферирующих клеток всосочковом слое дермы и нижних слоях эпидермиса.В целом, исходя из иммуногистохимического анализа ожога кожи,можно сделать вывод о том, что вводимые препараты положительно влияютна регенеративные процессы в ткани. Наибольшая пролиферативнаяактивность клеток и нарастание массы эпидермиса было отмечено впрепарате с Prx 6 и факторами МСК, следовательно, нейтрализацияокислительного стресса в ткани с помощью пероксиредоксина 6 ипоследующее стимулирование клеток к делению факторами МСК лучшевсего подходит для регенерации кожи после химического ожога.1.2.4.

Роль Prx6 в нейтрализации окислительного стресса вожоговой ранеЧерез 1 час после ожога при использовании Prx 6 концентрация МДА вожоговой ране уменьшается в 1,5 раза по сравнению с контрольной группой82(физический раствор). К третьим суткам концентрация МДА в контрольной иопытной группе одинакова и соответствует концентрации МДА в здоровойкоже (рис. 22).Концентрация, нмоль/г180160Физ.раствор140120Prx 6*10080*6040200здороваяожог 1 часожог 1 сутожог 3 сутРис.

22. Концентрация малонового диальдегида в ожоговой ранепри лечении Prx 6 (уровень перекисного окисления)*- достоверно по отношению к контролю (здоровая кожа) (р<0,05), N=15Таким образом, нейтрализация окислительного стресса с помощьюферментов-антиоксидантов в начальной стадии заживления полнослойноймеханической раны также является важным фактором для ускорения ихзаживления.1.2.5. Влияние Prx6 и к МСК на интерлейкиновый профильожоговой раныАнализ цитокинового профиля (рис. 23) показал, что в группе спрепаратом Prx 6 относительное содержание всех исследуемых цитокиновбыла ниже, чем в группе с применением физиологического раствора.Наблюдается меньший рост концентрации интерлейкинов IL 6 и IL 10 вгруппе с препаратом паракринных факторов мезенхимальных стволовыхклеток.83В группе с препаратом фермента-антиоксиданта Prx6 совместно спаракринными факторами МСК, можно наблюдать динамику сниженияотносительной концентрации цитокинов, уровень цитокинов при этомдостоверно значим относительно контроля (здоровая кожа).

При этомконцентрацияпротивовоспалительногоцитокинаIL-10выше,чемпровоспалительного IL-6.Рис 23. Концентрация интерлейкинов в ожоговой ране прииспользовании Prx 6 и кМСКОтносительная концентрация интерлейкинов в ране через 24 часа после нанесенияожога ТХУ. Данные рассчитаны относительно контроля (здоровая кожа) ± SE(стандартная ошибка). N=15. Контроль принят за 100%.*- достоверно по отношению к контролю (р<0,05)Исходя из результатов анализа профиля цитокинов, также можносделать вывод о том, что в группе с препаратом Prx6 и паракриннымифакторами МСК активнее всего проходят процессы клеточной пролиферациии заживления ткани, так как общих уровень цитокинов, стимулирующихвоспаление, в данной группе снижен.

Данный вывод также подтверждаетуровеньотносительнойконцентрациипротивовоспалительногоIL-10,84который повышен в тканях, где наблюдается активный процесс воспаления инекроз.1.2.6. Влияние Prx6 и кМСК на биохимические показатели кровипри химическом ожоге кожиПоскольку активность ферментов АЛТ и АСТ в крови бываетповышена из-за различных физических травм, включая ожоговые и иныераны, то снижение активности данных ферментов может свидетельствоватьоб уменьшении воспаления в очаге поражения.АЛТ50U/L403020350*300***250U/L60АСТ200***150100105000Рис 24.

Активность ферментов AСT и AЛT в сыворотке кровикрысы при химическом ожоге через 24 часа после нанесения ожога ТХУ*- достоверно по отношению к контролю (здоровая кожа) (р<0,05), N=15Было показано, что активность ферментов АЛТ и АСТ в сывороткекрови здоровой крысы составляют 29±5 U/L и 115±8 U/L соответственно.При химическом ожоге (рис. 24) в группе с физиологическим растворомактивность АЛТ и АСТ составляла 50±2 U/L и 282±21 U/L соответственно.Во всех группах, где проводилось введение препаратов, активностьАЛТ и АСТ сильно снижена, по сравнению с группой, в которой лечение85ожога проводилось физиологическим раствором.

Так, активность АЛТ вопытных группах снижена более чем в 2,5 раза (Prx 6 - 19±5 U/L; кМСК 14±2 U/L; Prx 6 +кМСК - 17±3 U/L). Применение исследуемых препаратовпри химическом ожоге кожи ведет к нормализпции показателей активностиАСТ в крови крысы, причём он ниже активности АСТ здоровой крысы.Исходя из результатов биохимического анализа крови, применение Prx6 и паракринных факторов МСК способствует снижению ферментативнойактивностиАЛТ и АСТ, что указывает на положительный эффектприменения данных препаратов на заживление ожоговой раны и организма вцелом.1.2.7. Роль пероксидазной активности экзогенного Prx6 прихимическом ожоге кожиВ связи с тем, что Prx6 является полифункциональным ферментом,(обладает как пероксидазной, так и фосфолипазной активностями, и способенвзаимодействовать с Toll-подобными рецепторами) [Fisher A.B., 2011] былисследован эффект мутантного Prx6, не обладающего пероксидазнойактивностью, (с сохранением фосфолипазной активности и взаимодействиемс TLR4-рецептором).

В работе был использован Prx6C47S (мутантный Prx6),в котором проведена точечная замена в активном центре Prx6 человекацистеина в 47 положении на серин. Данная мутация C47S полностьюингибирует пероксидазную активность Prx6, но не приводит к структурнымизменениям белка.86Рис. 25. Внешний вид ожога на 10 сутки после применения Prx 6 иPrx6C47S А –Prx 6; Б – Prx6C47SПрименение мутантного белка Prx6C47S, который не обладаетпероксидазной активностью, не оказывает положительного влияния напроцесс заживления ожоговой раны. Так, ожоговая рана на 10 сутки сиспользованием Prx 6 практически полностью эпителизирована, в то времякак использование Prx6(C47S) не даёт значимых результатов (рис.25).ПосколькумутантныйPrx6,необладающийпероксидазнойактивностью, не влиял никаким образом на процессы заживления кожныхран, именно пероксидазная активность Prx6 является основной в данномпроцессе.872.

Влияние экзогенного Prx6 и паракринных факторов МСК(кМСК) на динамику заживления механической полнослойной кожнойраныОценка влияния экзогенного Prx6 и паракринных факторов МСК былатак же проведена на модели механической полнослойной кожной раны.Данная модель отличается от модели химического ожога в первую очередьпо механизму заживления раны. Механическая рана заживает посредствомвторичного натяжения, а химический ожог – под струпом.2.1. Влияние Prx6 и кМСК на морфологию механической раныВ контрольной группе отмечается минимальная динамика образованиягрануляционнойтканивпервые14дней(вприсутствиеантиконтракционного кольца) и низкая скорость уменьшения площади раныв последующие дни (после удаления кольца) (рис.

26А). Следует отметить,что после извлечения устройства из раны, ее заживление происходило откраев раны к центру (рис. 1А).Применение Prx 6 позволило сократить время заживления раны. Впервые дни наблюдалось обилие гнойного экссудата, от которого ранаочищалась к 4–5 суткам.

Активировались репаративно-регенераторныепроцессыивозросласкоростьобразованиягрануляционнойткани.Замещение раневого дефекта после удаления кольца из раны произошло вменьшие сроки (рис. 26Б) по сравнению с контролем.Кондиционированная среда МСК благотворно влияла на ход процессарегенерации, увеличивая скорость образования грануляционной ткани. Приэтом следует отметить, что закрытие раневого дефекта полсе удалениякольцапроисходилопосредствомконтракции,чтохарактернодлязаживления ран первичным натяжением (рис. 26В).Комбинированноеиспользованиедвухкомпонентовдостоверноускоряло заживление раны, как относительно контроля, так и по сравнению сопытными группами 1 и 2 (рис.26Г).88Рис.26.Заживлениемеханическойполнослойнойраныприиспользовании Prx 6 и кМСКВерхний ряд – вид раны сверху после удаления антиконтракционного кольца (14дней после травмы); нижний ряд – вид раны сверху через 14 дней после удаленияантиконтракционного кольца (28 дней после травмы).А –физ.