Диссертация (1174190), страница 15

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 15)

Данные рассчитаны относительно контроля (здоровая кожа) ± SE (стандартнаяошибка). N=15. Контроль принят за 100%.*- достоверно по отношению к контролю (р<0,05)В анализе на наличие Ki-67 было отмечено, что в группах, где посленанесения раны использовались Prx 6 паракринные факторы МСК исочетание Prx6 и паракринных факторов МСК, относительная концентрациябыла выше в 2 раза по сравнению с группой, где применялся97физиологический раствор.

Применение Prx 6 так же ведёт к увеличению Ki67 в ране (рис. 31). Таким образом, Prx 6 и паракринные факторы МСКувеличиваютстепеньпролиферации,причёмнаибольшийэффектнаблюдется при их совместном применении.2.4. Влияние Prx6 и кМСК на биохимические показатели кровипосле нанесения механической раныПосле нанесения механической полнослойной кожной раны, вконтрольной группе (физический раствор) через 24 часа активность АЛТ иАСТ составляла 59±5 U/L и 361±14 U/L соответственно (рис. 32).Во всех группах, где проводилось нанесение препаратов на зонупоражения, активность ферментов АЛТ и АСТ сильно снижены, посравнению с группой, где применялся физиологический раствор. АктивностьАЛТ в группах с применением препаратов снижена в 3 и более раза (Prx 6 24±4 U/L; кМСК - 15±2 U/L; Prx 6 +кМСК - 17±2 U/L). Применениеисследуемых препаратов так же ведет к значительному снижениюактивности АСТ в крови (Prx 6 - 138±10 U/L; кМСК - 111±6 U/L; Prx 6+кМСК -129±7 U/L).80706050403020100АСТ**U/LU/LАЛТ350300250200150100500***Рис 32.

Активность ферментов AСT и AЛT в сыворотке кровикрысы после нанесения механической раны при использовании Prx 6 икМСК через 24 часа*- достоверно по отношению к контролю (р<0,05), N=1598Исходя из результатов биохимического анализа крови, применение Prx6 и паракринных факторов МСК способствует снижению активностиферментов АЛТ и АСТ, что свидетельствует о положительном влиянииданных препаратов на общее состояние организма в целом, и как следствиена улучшение процессов регенерации в поражённой ткани. Эти данныесоотносятся с данными, полученными для модели химического ожога кожи.99IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯВ данной работе для ускорения заживления ран были исследованы (1)вкладэкзогенныхферментов-антиоксидантоввнейтрализациюокислительного стресса и (2) вклад паракринных факторов мезинхимальныхклеток в ускорение процессов пролиферации клеток.Как упоминалосьранее, в работе были использованы две принципиальные модели заживленияраны: заживление раны проходило под струпом (химический ожог) и путемвторичного натяжения (механическая рана).Оценка динамики регенерации кожи при химическом ожоге показала,что окислительный стресс наблюдался в течение первых 7 дней посленанесения ожога.

Эти результаты согласуются с другими исследованиями, вкоторых сообщается об увеличении перекисного окисления липидов втечение первых двух недель после нанесения ожоговых травм [ДубининаЕ.Е.идр.;2001].Болеетогонаблюдалосьснижениеактивностиантиоксидантных ферментов, связанных с нарушением микроциркуляции,истощением антиоксидантной системы и, соответственно, усугублениемстепени поражения ткани вследствие окислительного стресса.Концентрация одного из продуктов свободно-радикального окислениялипидов, малонового диальдегида (МДА), накопление которого отражаетстепень окислительного стресса в организме, в коже через 1 час посленанесения химического ожога вырос в 2,5 раза. Через сутки концентрацияМДА в ожоговой ране уменьшилась, а к третьим суткам была статистическинезначимой по сравнению со здоровой кожей. Оценка данного показателя вожоговой ране показала, что при химическом ожоге в коже возникаетмощный окислительный стресс, который губительно действует на клетки,препятствуя нормальному течению процесса заживления кожной раны.Таким образом, химический ожог на первом этапе сопровождаетсямощнымокислительнымстрессом,которыйувеличиваеттяжесть100поражения ткани, и соответственно, приводит к удлинению сроковзаживления раны.В частности, химический ожог сопровождается увеличением уровняосновного маркера клеточной гибели каспазы 3 и незначительнымувеличением фактора пролиферации Ki-67.

Это приводит увеличению сроковрегенерации кожных ран, а так же большой вероятности образованиябольшого рубца. Концентрация каспазы 3, основного маркера клеточнойгибели, в коже крысы через 1 час после нанесения ожоговой раны в 2,3 разавыше, чем в здоровой коже, к седьмым суткам уровень каспазы 3 впораженной коже падает. Уровень Ki-67 в поражённой коже достигаетмаксимума лишь через 24 часа, а далее постепенно уменьшается по мерезаживления раны.УровеньпровоспалительныхцитокиновIL-1,IL-6,которыевысвобождаются тканевыми макрофагами и моноцитами в ответ на любоеповреждение,ипротивовоспалительногоцитокинаIL-10вкожеувеличивается в 1,5-2 раза после нанесения химического ожога. Цитокин IL1 способствует активации фагоцитов и их миграции в очаг воспаления,участвует в индукции апоптоза.

Под влиянием IL-1 повышается синтез IL-6,важнейшего медиатора острой фазы воспаления, который продуцируетсяфибробластами, активированными моноцитами и макрофагами. Цитокин IL10 функционирует в антивоспалительном ключе, секреция этого цитокина непозволяетвоспалениюприобрестинеконтролируемыйхарактер.Привоспалительных процессах в коже помимо выделения цитокинов, происходитинтенсивное выделение NO и его генерация превышает нормальныйфункциональный уровень, что подтвердилось в данном исследовании намодели химического ожога кожи.В данном исследовании в качестве фермента-антиокиданта длянейтрализации окислительного стресса был выбран экзогенный человеческийрекомбинантный Prx 6. Визуальная и гистологическая оценка эффективности101применения Prx 6 при химическом ожоге показала, что использованиеданныхпрепаратовзначительноувеличиваетскоростьрегенерациипоражённой кожи, чем в контрольной группе (в 2-3 раза).

Это обусловленонейтрализацией окислительного стресса (по малоновому диальдегиду),уменьшением апоптоза (по каспазе 3), увеличением пролиферации клеток (поKi-67) в ткани раны при применении фермента-антиоксиданта, уменьшениемуровней провоспалительных и противовоспалительных цитокинов (IL-6, IL-8,IL-10).Для выявления роли именно пероксидазной активности Prx6 ) [FisherA.B., 2011] в прорегенеративных и протекторных эффектах был использованмутантныйPrx6,которыйнеобладаетпероксидазнойактивностью(Prx6C47S). Было показано, что использование Prx6C47S не оказывалоникакого влияния на регенерацию ожоговой раны.

Именно это указывает наосновнуюрольпероксидазнойактивностивпротекторныхипрорегенеративных свойствах фермента Prx6, а так же говорит о том, чточрезмерное формирование АФК является одной из основных причин длямассивного повреждения клеток при травме кожи. Аналогичные результатыбыли получены ранее при ожоге трахеи [Volkova A.G.

et al., 2014]. Следуетотметить, что Prx6, взаимодействуя с рецептором TLR4, может влиять наразличные внутриклеточные процессы. Однако, мутантный Prx6, необладающий пероксидазной активностью, не влиял никаким образом напроцессы заживления кожных ран, именно пероксидазная активность Prx6является основной в данном процессе.Аналогичный эффект экзогенного Prx6 был так же показан на моделимеханической полнослойной кожной раны. Гистологический анализ показал,что в механической полнослойной ране на 14 сутки накраях раневогодефекта кожи отмечена пролиферация клеток базального слоя эпидермиса,наползающего, по мере формирования и созревания грануляционной ткани,на её поверхность. В участках кожи краевой зоны отмечена пролиферациялипоцитов шеек волосяных фолликулов.102В механической ране Prx 6 уменьшает выделение Cas 3 в клеткахпоражённой ткани, а следственно снижают интенсивность апоптоза, а так жеувеличиваютстепеньпролиферации.ПрименениеPrx6улучшаловаскуляризацию грануляционной ткани, через 14 и 28 суток, чтосвидетельствует о благоприятном действии данного фермента на заживлениеран.

Наибольший эффект наблюдается в первые дни, что, вероятнее всего,связано с нейтрализацией окислительного стресса.Действительно, нейтрализация окислительного стресса с помощьюферментов-антиоксидантов в начальной стадии заживления полнослойноймеханической раны также является важным фактором для ускорения ихзаживления.

Следует отметить, что поскольку Prx6 является белковоймолекулой, то соответственно, по-видимому, он не может проникать черезклеточную мембрану. Отсюда следует, что Prx6 нейтрализует, в первуюочередь, избыточные формы кислорода в межклеточном пространстве,защищая мембраны клеток от ПОЛ.Оценка эффективности применения паракринных факторов МСК прихимическом ожоге показала, что использование данных препаратовзначительно увеличивает скорость регенерации поражённой кожи, чем вконтрольной группе (в 1,5-2,5 раза).

Это обусловлено уменьшением апоптоза(по каспазе 3) и увеличением пролиферации клеток (по Ki-67) в ране,уменьшениемуровнейпровоспалительныхипротивовоспалительныхцитокинов (IL6, IL8, IL10).Эффект паракринных факторов МСК был так же показан на моделимеханической полнослойной кожной раны. аракринные факторы МСКснижаютинтенсивностьапоптоза,атакжеувеличиваютстепеньпролиферации. Наиболее отчетливо пролиферативная активность липоцитовотмеченавгруппесприменениемпаракринныхфакторовМСК.Использование паракринных факторов МСК увеличивало процентноесодержание фибробластов в ране и тем самым ускоряло процесс созреваниягрануляционной ткани.103Такимобразом,паракринныефакторыМСКпоказалисвоюэффективность на обеих моделях заживления ран, при этом наибольшийэффект наблюдался при их использовании при заживлении механическойполнослойной раны.

По-видимому, это связано с тем, паракринные факторыМСК способствуют миграции фибробластов в зону поражения, которые, всвою очередь, синтезируют коллаген, что играет ведущую роль взаживлении механической полнослойной раны.Если в случае Prx6 его эффект связан с пероксидазной активностью,то в случае с паракринными факторами МСК этот вопрос по-прежднемуостается открытым. Это объясняется тем, что в культуральной средеМСК содержатся различные факторы, в частности, HGF, VEGF, KGF,FGF, EGF и др. Поэтому, в настоящее время трудно объяснить, какие изфакторов МСК являются ведущими при заживлении ран.Поскольку иPrx6,ипаракринныефакторыМСК проявлялиположительный эффект при заживлении ран, и при этом они имели, повидимому, разный механизм действия, то целесообразно было рассмотретьих совместный эффект на обеих моделях кожных ран.

Характеристики

Список файлов диссертации