Диссертация (Регенеративные и протекторные эффекты экзогенного пероксиредоксина 6 и паракринных факторов мезенхимальных стволовых клеток при химических и механических травмах кожи), страница 7

По сравнению с другими антиоксидантами, концентрациятиоредоксина в клетке низка.Пероксиредоксины(Prx)разрушаютгидропероксидыкакорганической, так и неорганической природы, в том числе пероксинитриты(КФ 1.11.1.15) [Hofmann B. et al., 2002]. Это наиболее древние пероксидазы,которые по аминокислотной последовательности не проявляют гомологии сдругими пероксидазами и SOD.

Пероксиредоксины могут иметь различную38локализацию в клетке и составляют до 1% от растворимой формы белка вклетке [Karplus P.A. et al., 2007]. Для катализа эти пероксидазы используют вактивном центре консервативный остаток цистеина (Cys), а так же несодержат каких-либо окислительно-восстановительных. Скорость реакции ~105 M−1s−1. Кроме пероксидазной активности, некоторые пероксиредоксиныпроявляют шаперонную и фосфолипазную активность [Fisher A.B., 2011;Chae H.Z. et al., 2012].

Имеется большое количество работ, указывающих наважное место представителей этого семейства в антиоксидантной защитнойсистеме различных органов [Kinnula V.L. et al., 2004; Kümin, A. et al., 2007;Power J. et al., 2008; Volkova A.G. et al., 2014, Gordeeva A.E. et al., 2015;Palutina O.A. et al., 2015; Gordeeva A.E., 2015]. Данный аспект требуетрассмотрения этого семейства пероксидаз подробнее.4.2.

ПероксиредоксиныСовременная классификация пероксиредоксинов основана на числецистеинов в активном центре и особенностях механизма катализа и включаеттри подсемейства: 1Cys (Prx6), типичные 2Cys (Prx 1-4) и атипичные 2Cys(Prx5). Аминокислоты, которые формируют пероксидазный каталитическийцентр для всех пероксиредоксинов весьма высококонсервативны [Wood Z.A.et al., 2003].Несмотряхарактернойначертойотличиявсемействааминокислотнойпоследовательности,пероксиредоксинов(Prxs)являетсяконсервативная тиоредоксиновая укладка, которая включает в себя три αспирали и четыре β-структуры.

Структурные различия между представителянаблюдается на уровне четвертичной структуры. Так 1Cys Prx – этогомодимеры, атипичные 2Cys Prx – мономерные формы фермента, в то времякак типичные 2Cys Prx могут быть или гомодимерами, или олигомерами[Karplus P.A. et al., 2007; Ren G. et al., 2009; Chae H.Z. et al., 2012].Пероксидазная активность Prxs обусловлена наличием консервативныхостатковцистеина(Cys)вN-концевомиС-концевомположениях39полипептидной цепи. Ключевым для катализа являетсяN-концевойпероксидазный остаток цистеина (CP) в положении 47. Однако для«атипичных» Prxs требуется и остаток цистеина в С-концевой области – этодополнительный восстанавливающий остаток цистеина (СR). ПероксидазныйостатокцистеинаокружентремяконсервативнымидляPrxsаминокислотными остатками: Pro44, Thr48 Arg27 (нумерация для 2Cys Prx).Остаток Pro44 прикрывает пероксидазный остаток от растворителя, а Thr48 иArg127 образуют с атомом серы этого остатка водородные связи, способствуяактивации этого цистеина.

Таким образом, Thr48 и Arg127 необходимы дляпероксидазной активности пероксиредоксина [Wood Z.A. et al., 2003; PerkinsA. et al., 2013].Каталитическийцикл,вкоторомпроисходитферментативнаядеградация органических и неорганических гидропероксидов включает триэтапа [Chae H.Z. et al., 2012]. На первом этапе, происходит взаимодействиеперекиси с пероксидазным цистеином.

При этом в результате восстановленияпероксида, тиольная группа (-SH) пероксидазного цистеина (Ср) окисляетсядо сульфеновой кислоты (–SOH), возможно и дальнейшее её окисление досульфиновой (CP-SO2H) и сульфоновой (CP-SO3H) кислот. При этом толькосульфеновая кислота восстанавливается тиолами до реакционоспособнойформы CP-SH, в то время как CP-SO3H – это необратимо окисленная форма.Именно восстановление сульфеновой кислоты происходит на втором этапекаталитического цикла, при этом образуется внутри или межмолекулярнаядисульфидная связь. Типичные 2Cys Prx образуют дисульфидную связьмежду цистеинами двух мономеров (CP-S-S-CR), атипичные 2Cys Prxобразуют внутримолекулярную в пределах одной полипептидной цепи (CPS-S-CR), а 1Cys образуют связь с низкомолекулярными тиолами (CP-S-S-R).НаличиеэтойреакциипредохраняетпероксидазныйцентрPrxотдальнейшего необратимого окисления субстратом, тем самым поддерживаяактивностьфермента.Натретьемэтапе,дисульфидныесвязивосстанавливаются тиолами.

В случае типичных и атипичных 2Cys Prx для40восстановления связей часто служит тиоредоксин (Trx). В настоящее времяпроцесс восстановления Cp-S-S-R групп для 1Cys Prx недостаточно изучен.Показано,чтоCp-SOH,низкомолекулярнымиможеттиолами,бытьвосстановленнапример,глутатионом,некоторымиспомощьюглутатион S-трансферазы π.Это может быть связано с тем, что в результате взаимодействия 1CysPrx и глутатион S-трансферазы π активный центр 1Cys Prx разворачивается истановится доступным для молекулы глутатиона [Woo H.A. et al., 2003;Manevich Y. et al., 2007; Chen H.Z. et al., 2013].Подобноперекисям,пероксинитритявляетсяокислителемдлябелковых SH-групп, и приводит к образованию нитрита и сульфенатов,которое в присутствии конформационно доступных остатков цистеина могутобразовывать внутримолекулярные дисульфиды.

Пероксинитриредуктазнаяактивность в отличие от пероксидазной, не является характерной для всехпредставителей семейства. Она была показана для Prx5 и Prx2 человека[Dubuisson H. et al., 2004; Manta B. et al., 2009], для Prx 1 и Prx 2 дрожжей[Ogusucu R. et al., 2007], для Prx6 [Peshenko I.V. et al., 2001].Активность Prxs регулируется на уровне транскрипции генов для Prx.Основным фактором, который влияет на уровень экспрессии генов окислительный стресс [Bertoletto P.R. et al, 2012; Tahmasbpour Marzony E etal., 2016]. Показано изменение экспрессии генов Prx при травмах [Huang S.

etal, 2015], новообразованиях [Lee E.Y. et al., 2015; Peroja P., 2016] придифференцировке клеток [Ma Y. et al., 2014; Xi H. et al., 2014].РегуляцияактивностиPrxsпроисходиттакжеинауровнепострансляционных модификаций, которые включают фосфорилирование,ацетилирование, глутатионилирование и тиольное окисления [Requier S. etal.,2014].Пострансляционныемодификациисвязанныесфосфорилированием, приводят к ингибированию активности фермента из-заформированияструктуры,неблагоприятнойдляосуществленияферментативной реакции [Jeon Y.J.

et al., 2014]. Пероксиредоксины,41нейтрализуя перекиси и пероксинитриты, проявляют антиоксидантнуюактивность. [Wood Z.A. et al., 2003; Requier S. et al., 2014; Rhee S. G. et al,2016].4.2.1. Роль пероксиредоксинов в защите клеток от окислительногострессаСредипероксиредоксиновпозвоночныхнаиболееохарактеризованными являются Prxs млекопитающих. У млекопитающихобнаружено 6 представителей этого семейства, которые разделены на триподсемейства: типичные 2Cys (Prx1–4), aтипичный 2Cys (Prx5) и 1Cys (Prx6).В настоящее время представителям этого семейства отводится незаменимаяроль в защите от окислительного стресса при различных патологиях [PerojaP.

et al, 2016; Knoops B. et al., 2016].Пероксиредоксин 1 - белок, имеющий молекулярную массу 22 кДа,широко представленый как в норме, так и при различных патологияхпрактически во всех органах и тканях млекопитающих. В клетках Prx1локализуется в цитоплазме, ядре, митохондриях и пероксисомах [ImmenschuhS. et al., 2003]. Окислительный стресс играет главную роль в усиленииэкспрессии генов Prx1 [Huang S. et al, 2015; Tahmasbpour Marzony E et al.,2016].

Высокий уровень экспрессии Prx1 в тканях млекопитающихнаблюдается при онкологиях: пищевода, поджелудочной железы, легких,щитовидной железы [Ishii T. et al., 2012; Lee E.J. et al., 2015; Park M.H. et al,2016]. Было показано, что внеклеточная форма Prx1 человека связывается срецептором TLR4 и стимулирует секрецию TNFα и IL6 макрофагов мыши(или незрелых дендритных клеток), действуя как провоспалительный фактор.Связывание с рецептором TLR4 не зависит от пероксидазной активностиPrx1 [Ishii T.

et al., 2012].Пероксиредоксин 2 - состоит из 198 аминокислотных остатков, и вотличие от Prx1 не содержит дополнительного остатка цистеина (Cys83). Вклетке имеет цитозольную локализацию. Это основной антиоксидантный42фермент эритроцитов человека [Benfeitas R. et al., 2014]. Большая часть работпо исследованию Prx2 в клетке указывает на его роль в опухолевыхпроцессах. Сверхэкспресия белка приводит к увеличению устойчивостиклеток к действию различных протиопухолевых препаратов и защищаетопухолевые клетки от окислительного стресса и апоптоза [Park Y.H.

et al.,2015; Kwon T. et al., 2016; Peroja P. et al., 2016].Пероксиредоксин 3 (c-myc, miR-383 или miR-23b target gene) - состоитиз 257 аминокислотных остатков. На N-конце Prx3 имеет сигнальнуюпоследовательность для проникновения в митохондрии, где он локализован.Prx3 является незаменимым ферментом для нормального функционированиямитохондрий, а уменьшение его уровня вызывает сильные морфологически ифункциональные нарушения органелл [Wonsey D.R. et al., 2002].

Экспресииягена для Prx3 индуцируется окислительным стрессом и защищает клетки отгиперпродукции АФК [Liu M.H., 2015; Tahmasbpour Marzony E. et al, 2016].Пероксиредоксин 4 – состоит из 271 аминокислотного остатка идоминирует в печени, семенниках, яичниках и мышцах. Prx4 локализуется вовнеклеточномпространствеивнутриклеток,например,внутриэндоплазматической сети [Tavender T.J. et al., 2008]. Prx4 играет важную рольв защите организма от окислительного стресса. Показана протекторная рольPrx4 в сперматогенезе/овогенезе и его необходимость для созреваниясперматозоидов и фолликул у млекопитающих [Iuchi Y.

et al., 2009; Qian Y. etal., 2016]. У трансгенных мышей с гиперэкспрессией Prx4 в модели сахарногодиабета 1 типа, β - клетки поджелудочной железы имели низкие показателиапоптоза, что указывало на важную роль Prx4 в снижение их поражения[Ding Y. et al., 2010].Пероксиредоксин 5 – состоит из 214 аминокислотных остатков ипредставлен в цитоплазме, митохондриях, пероксисомах и ядре. От другихпредставителей2Cysпероксиредоксиновегоотличаетмеханизмферментативной реакции и наименьший молекулярный вес (22кДа непроцессированная форма, а также 17 кДа – форма после отщепления43сигнальногопептида).дополнительныйДляостатокферментативногоцистеинавкатализаС-концевойтребуетсяобласти–восстанавливающий остаток цистеина (СR).

[Wood Z.A. et al., 2003]. Prx5восстанавливает пероксид водорода и алкилгидропероксиды, помимо этоготакже, как Prx2 и Prx6, способен к восстановлению пероксинитрита[Dubuisson H., et al., 2004]. Значительные уровни Prx5 были обнаружены вмикроглии при воспалительных процессах. Индуцированная экспрессиябелка опосредовала снижение активации микроглии и генерации оксидаазота и модулировала АФК-зависимый сигнальный каскад [Sun H.N. et al.,2010].Пероксиредоксин 6 - представитель 1-Cys Prx, содержащий толькоодинактивныйостатокцистеина(Cys47).Протекторныйэффектпероксиредоксина 6 был показан при патологиях кожи [Kümin A.