Диссертация (Регенеративные и протекторные эффекты экзогенного пероксиредоксина 6 и паракринных факторов мезенхимальных стволовых клеток при химических и механических травмах кожи), страница 9

В связи с этим, наличие антиоксидантной активности у препарата или49фармакологическогосочетания,какправило,позитивнымобразомсказывается на их регенеративном действии.С нашей точки зрения, выбор в качестве пероксидаз для данногоисследования именно пероксиредоксинов (в частности перексиредоксина 6)является наиболее предпочтительным. Это определяется несколькимифакторами:1.Пероксиредоксин 6 обладает способностью нейтрализовать какнеорганические, так и органические гидропероксиды.

Каталаза такойспособностью не обладает.2.Кинетическиепоказывают,чтохарактеристикипрималыхферментативныхконцентрацияхреакцийгидпропероксидовпероксиредоксин 6 существенно эффективнее в их нейтрализации, чемкаталаза или глутатионпероксидазы, что позволяет Prx6 нейтрализоватьгиперпродукцию АФК в начальной стадии их образования [Fisher A.B.,2011].3.Пероксиредоксин6–единственныйпредставительпероксиредоксинов, который, являясь секреторным белком, способензащищать клетки от внешних источников гидропероксидов.4.Пероксиредоксин 6 является одним из основных антиоксидантовкожи, локализуясь приемущественно в верхнем слое эпидермиса, волосяныхфолликуллах и сальных железах.5.

Факторы, регулирующие процессы регенерации вэпителиальных тканяхНа разных стадиях дифференцировки клеток эпителия в процессерегенерации активируются рецепторы к различным цитокинам, которыеявляются основными регуляторами репарации. Цитокины продуцируютсяальвеолярными макрофагами, нейтрофилами, эпителиальными клетками,50лимфоцитами и фибробластами. К фиброгенным цитокинам относятсятрансформирующийфакторростабета(TGF-β),факторростатромбоцитарного происхождения (PDGF), гранулоцитарно-макрофагальноколониестимулирующий фактор (GM-CSF) и основной фактор ростафибробластов (FGF).

Альвеолоциты II типа могут пролиферировать игенерировать как себе подобные клетки, так и альвеолоциты I типа, а такжефакторы роста, такие как фибропластический фактор роста (FGF) и егосемейство (FGF1), фактор роста кератиноцитов (KGF или FGF7), факторроста гепатоцитов (HGF), эпителиальный фактор роста (EGF) [Чучалин А. Г.,2007].Прогенераторное влияние экзогенного эпидермального фактора роста(EGF) на эпителий показано, например, на модели раны (царапины)слизистой оболочки голосовой складки. В присутствии экзогенного EGFскорость регенерации эпителия увеличилась в два раза по сравнению сконтролем.

Кроме этого, при использовании EGF в прилегающих к ранетканяхобнаруженоувеличениеконцентрациибелкаKi67,чтосвидетельствует об интенсификации пролиферации клеток эпителия [PalenciaL. et al., 2015].Таким образом, в регуляции репарационных процессов в эпителииключевое значение имеют такие факторы роста, как эпидермальный факторроста (EGF), фактор роста кератиноцитов (KGF), фактор роста гепатоцитов(HGF), факторы роста фибробластов (FGF).5.1.

Паракринные факторы мезенхимальных стволовых клетокНасегодняшнийденьсуществуетмногоработ,посвящённыхиспользованию мезенхимальных стволовых клеток (МСК) для регуляциивоспалительных процессов при повреждениях тканей, в послеоперационномпериоде и в других случаях. Как правило, эффективность применения МСКподтверждается на примерах различных тканей: при почечной, печёночной и51лёгочной патологиях, рассеянном склерозе, инфаркте миокарда. При этомбыло показано, что использование кондиционированной среды МСК прилечении острых патологических состояний не уступает применению самихМСК.

Например, Deng и группа исследовали терапевтический эффектприменяемых раздельно МСК и кондиционированной среды, в которойкультивировались эти клетки, при лечении тех мышц и нервов крыс, которыечаще всего повреждаются при родах. Результаты позволили авторам сделатьвывод о равнозначном позитивном эффекте этих препаратов. Авторы пришлик заключению о том, что эффективность МСК при таком типе поврежденийполностью определяется эффективностью их паракринных факторов [DengK. et al., 2015].

К аналогичному выводу пришла группа, изучавшая эффектМСК костного мозга человека и их паракринных факторов на моделикишечной невропатии у морских свинок. При ректальном введении этихпрепаратов в обоих случаях наблюдается уменьшение потерь нейроновмышечной оболочки кишечника, снижение нарушений моторики толстойкишки и предотвращение значительной потери в весе животного [RobinsonA.M. et al., 2014].Таким образом, можно говорить о паракринном терапевтическомэффектеМСК,которыйподразделяютнатриаспекта:противовоспалительное, антиапоптотическое и прогенеративное действия[Temnov A.

A. et al., 2010]. Прогенераторный эффект паракринных факторовМСК связан с высокой концентрацией среди них факторов роста, таких, какHGF, VEGF, KGF, FGF, EGF. Интенсивность секреции этих факторовповышается в ответ на повреждение. Например, показано, что паракринныйэффект МСК можно усилить путём предварительного воздействия настволовые клетки ФНОα, IL-1β и оксидом азота. Усиление паракринноготерапевтического эффекта в этом случаепроявляется в увеличениипродолжительности жизни крыс, подвергнутых радиоактивному облучению[Chen H. et al., 2015]. По сравнению с фибробластами кожи, МСК костногомозга более обильно секретируют EGF, KGF, IGF-1, VEGF-α, PDGF-BB, EPO52и TPO, но менее обильно – IL-6 и остеопротегирин [Chen L. et al., 2008].Создавая вокруг себя среду, насыщенную факторами роста, МСК создаютхорошие условия для пролиферации клеток.Противовоспалительный эффект связан со снижением концентрациипровоспалительных цитокинов: IL1, IL6 и TNF-α [Rawlins E.L.

et al., 2007].Антивоспалительное действие белков кондиционированной средыМСК костного мозга было продемонстрировано на примере фиброза лёгких,сопровождающегосявоспалениемлёгких,отложениемколлагенаиклеточным апоптозом [Shen Q. et al., 2014]. В in vitro модели диабета, приАФК-опосредованном угнетении миграции и пролиферации кератиноцитовглюкозой и липополисахаридами, использование белков среды МСК такжеимело положительный эффект. Под воздействием паракринных факторовбыла снижена продукция АФК, что привело к восстановлению нормальнойфункции кератиноцитов.

Авторы исследования пришли к выводу о том, чтобелки среды МСК могут лечь в основу новой стратегии по ускорениюзаживления ран кожных покровов [Li M. et al., 2015].Антиапоптотические свойства паракринных факторов МСК былипоказаны Huang и его группой. Астроциты головного мозга, подвергнутые invitroкислородно-глюкозномуреперфузированыголоданию,кондиционированнойбыли,средойводномМСК,вслучае,другом–культивировались вместе с МСК в течение 24 часов.

В обоих случаяхнаблюдается уменьшение апоптоза астроцитов, повышение активностиклеточногометаболизмаиснижениесверхэкспрессииглиальногофибриллярного кислого белка. Эффект от совместной культивации оказалсявыше эффекта от реперфузии [Huang W. et al., 2015].Эмбриональные человеческие МСК секретируют белок, связывающийинсулин-подобный фактор роста (IGFBP), которые уменьшают количествосвободногоинсулин-подобногоингибированиюобразом,белкиростаклетокфакторароста,гепатоцеллюлярнойкондиционированнойсредыМСКчтоприводиткарциномы.могуткТакимоказывать53специфическийантипролиферативный эффект на опухолевые клетки[Yulyana Y.

et al., 2015].54II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ1. Материалы1.1. Животные и этикаИсследования были проведены на белых крысах-самцах линии Wistarмассой 250 – 300 г, возрастом 8-10 недель, 80 особей, полученных из виварияИБК РАН г. Пущино. Работа с лабораторными животными проводилась всоответствиисположениями«Европейскойконвенцииозащитепозвоночных животных, используемых для эксперимента и других научныхцелей, 1986» и руководством по работе с лабораторными животными ИБКРАН №57.30.12.2011.Протокол эксперимента включал введение животного в длительныйнаркоз смесью растворов Zoletil® 100, «Virbac Sante Animale» (Франция) иRometar, «Bioveta» (Чехия). Наркоз вводился внутримышечно.1.2. Рекомбинантный человеческий пероксиредоксин 6Рекомбинантный пероксиредоксин 6 был получен в лабораториимеханизмов рецепции Института биофизики клетки РАН.Рекомбинантный пероксиредоксин 6 (Prx6), содержащий His-tag доменна карбоксильном конце, получен в лаборатории с помощью стандартныхгенно-инженерных методик.

Конструкция, содержащая белок-кодирующиепоследовательности пероксиредоксина 6 человека экспрессирована в клеткахE.coli.Выделениеиочисткаферментапроводиласьстандартнымибиохимическими методами (аффинная хроматография) до высокой степеничистоты (не менее 95% согласно SDS-электрофорезу) [Шарапов М.Г. и др.,2009].Удельные активность Prx6 - His-tag составляют: пероксидазная – 90120нмоль/мг/мингидропероксиду.поН2О2и60-80нмоль/мг/минпотрет-бутил-55Рис. 6. Структура пероксиредоксина 6 и его мутанта (Prx6C47S)В качестве контроля использовали мутантный Prx6 (Prx6C47S) (рис. 6),в котором проведена точечная замена в активном центре рекомбинантногоPrx6 человека, а именно цистеин в 47 положении замещен на серин. Даннаямутация C47S полностью ингибирует пероксидазную активность Prx6, но неприводит к структурным изменениям белка [Wood Z.A.

et al., 2003].Мутантная форма Prx6 также содержала His-tag на карбоксильном конце.Мутантный белок очищали по аналогичной схеме для Prx6.Минимальная концентрация, которую возможно использовать в случаелечения кожных ран 100 мкг/мл, что соответствует диапазону максимальнойэффективности белка in vivo (20-200 мкг/мл). Учитывая возможные потерибелка и предыдущие опыты in vitro [Волкова А.Г.

и др., 2014; Гордеева А.Е. идр., 2014] для лечения ран кожи была выбрана концентрация белка 1 мг/мл,которая не вызывает токсического эффекта у животных.Основныереактивыдлябиохимических,гистологических,иммунохимических и др. исследований указаны в соответствующих разделахметодов.1.3 Паракринные факторы МСКПолучение стволовых клеток костного мозгаДля выделения МСК костный мозг получали из бедренной кости крыслинии Wistar, находящихся под общим наркозом.

Мононуклеарную фракцию56клеток костного мозга выделяли на градиенте плотности с использованиемстандартного раствора Lympholyte-H (Cedarlane, Канада). После получениясуспензиимононуклеарных клеток их высевали на чашки Петри икультивировали в среде DMEM c добавлением 10% эмбриональной телячьейсыворотки.Для подтверждения свойств получаемых клеток были проведены тестыпоостеогенной, хондрогеннойстандартнойметодикеи адипогенной[ВладимировЮ.А.,дифференцировке2000].поОстеогеннаядифференцировка (с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки,100 мкМ дексаметазона, 0,1 мМ аскорбиновой кислоты и 10 нМ βглицерофосфата), была подтверждена наличием щелочной фосфатазы вкультуре клеток с использованием стандартных реактивов (Sigma-Aldrich,USA).