Диссертация (Влияние мутаций в прионизующем домене белка sup35 на свойства приона [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae), страница 4

cerevisiae как фактор, приводящий кусилению нонсенс-супрессии, вызываемой SUQ5 (мутантная тРНК, антикодонкоторой комплементарен триплету UGA)(Cox, 1964). Позднее удалосьустановить, что этот фактор отличается от уже известных мутаций в генахтранспортных РНК, имеющих сходное проявление. Такие мутации обычнолокализуются в антикодоне тРНК, что и приводит к ошибочному распознаваниюстоп-кодона. Различия между проявлением [PSI+] и мутантных тРНК заключаютсяв том, что мутации в тРНК аллелеспецифичны, т.е. могут «прочитывать» толькоодин из трех возможных стоп-кодонов. Фактор [PSI+] приводит к супрессииразличных нонсенс-мутаций (Liebman et al., 1979; Palmer et al., 1979; Chernoff etal., 1995). Аналогичный фенотип был обнаружен у мутантов по генам SUP35 иSUP45, но, в отличие от [PSI+], он характеризовался ядерным, а нецитоплазматическим наследованием (Cox et al., 1988). Природа этого агентаоставалась неясной до середины 90-х годов, когда было сделано предположение,что причиной супрессорного фенотипа [PSI+] является прионизация белка Sup35p(Wickner, 1994).Выдвинутая гипотеза полностью объясняла уже известные факты о [PSI+].Этотфакторобладаетдоминантнымцитоплазматическимхарактеромнаследования (Cox et al., 1988).

Он может теряться спонтанно (McCready et al.,1977; Cox et al., 1980) или под воздействием некоторых веществ (гидрохлоридгуанидина (ГГХ), метанол, этанол или диметилсульфоксид (ДМСО) и некоторыедругие) (Tuite et al., 1981), а также возникать de novo при сверхэкспрессии генаSUP35 (Chernoff et al., 1993). Этот же ген необходим для поддержания [PSI+] (Ter-19Avanesyan et al., 1994).Позднее были получены и другие доказательства прионной природыдетерминанта [PSI+].В цитоплазме клеток, несущих этот фактор, былиобнаружены агрегаты Sup35p (Patino et al., 1996; Paushkin et al., 1996; Paushkin etal., 1997). Этот белок мог спонтанно образовывать протяженные неразветвленныефибриллы in vitro. Эти агрегаты обладали всеми основными свойствамиамилоидов (Glover et al., 1997; King et al., 1997).

Важно отметить, что лизатыклеток [PSI+], а также фибриллы Sup35p ускоряли процесс агрегации этого белкаin vitro. Этот эксперимент продемонстрировал, что [PSI+] действительноиндуцирует конформационный переход Sup35p в его прионную изоформу, ставеще одним важным доказательством прионной концепции (Glover et al., 1997;Paushkin, 1997). Окончательным подтверждением гипотезы прионизации Sup35pстала трансформация клеток [psi-] фибриллами Sup35p. В этом эксперименте былодоказано, что для передачи приона [PSI+] от клетки к клетке достаточно толькоагрегатов Sup35p (King et al., 2006).

На сегодняшний день этот детерминантявляется одним из наиболее исследованных дрожжевых прионов (см. обзор(Liebman et al., 2012; Wickner et al., 2013)).3.3. [PSI+] и терминация трансляцииДля объяснения природы нонсенс-супрессорного фенотипа [PSI+] факторанеобходимо более подробно рассмотреть процесс трансляции, к регуляциикоторого Sup35p имеет непосредственное отношение.

Синтез белка, как и другиематричные процессы, подразделяется на три основные стадии: инициацию,элонгацию и терминацию. В ходе первой из них происходит сборка комплекса,состоящегоизрибосомы,матричнойРНК(мРНК)иметиониновойаминоацил-тРНК. Элонгация включает в себя процессы присоединения новыхаминокислот к растущему полипептиду и передвижения рибосомы по мРНК. Назавершающем этапе происходит разборка всего аппарата трансляции ивысвобождение синтезированной молекулы белка. После терминации в случаепрокариотических организмов может происходить реинициация белкового синтеза20(начало синтеза новой белковой цепи со следующей открытой рамки считывания вэтой же мРНК).

Для эукариот, поскольку их мРНК обычно кодируют только одинбелок, это явление не характерно, однако после завершения белкового синтезаможет осуществляться «рециклинг» рибосом, после которого происходит ещеодин раунд трансляции той же мРНК (см. обзор (Dever et al., 2012)).В эукариотических клетках каждый из описанных выше этапов трансляциирегулируется большим количеством белковых факторов. Процесс терминациитрансляции осуществляется факторами терминации трансляции eRF1 и eRF3(от eukaryotic Release Factor). Белок eRF1 относится к факторам терминациипервого класса и отвечает за распознавание нонсенс-триплетов и гидролизпептидил-тРНК (Frolova et al., 1994). В составе этого белка выделяют три домена,трехмерная укладка которых «мимикрирует» под структуру тРНК (Song et al.,2000).

Белок eRF1 in vivo функционирует в комплексе с фактором терминациитрансляции второго класса (eRF3), который является ГТФ-азой (Stansfield et al.,1995; Zhouravleva et al., 1995). Согласно последним данным, eRF3, связанный сГТФ, взаимодействует с eRF1 и способствует его проникновению в А-сайтрибосомы. Этот комплекс распознает стоп-кодон, затем за счет гидролиза ГТФизменяется конформация eRF1, и его центральный домен оказывается в пептидилтрансферазном центре. После этого АТФ-аза Rli1 замещает eRF3. КомплексeRF1:Rli1 за счет энергии АТФ запускает диссоциацию субъединиц рибосомы игидролиз пептидил-тРНК. На завершающем этапе eRF3 снова связывается с eRF1,что способствует освобождению последнего от субъединиц рибосомы (Dever etal., 2012; Eyler et al., 2013).В случае прионнизации Sup35p в клетках возникает фактор [PSI+], которыйприводит к нонсенс-супрессии in vivo (Cox, 1964; Liebman et al., 1979) и in vitro(Tuite et al., 1987).

В клетках с этим прионом белок Sup35 формирует агрегаты(Patino et al., 1996; Paushkin et al., 1996; Glover et al., 1997; King et al., 1997;Paushkin et al., 1997). Это приводит к снижению уровня мономерного eRF3,способного образовывать комплекс с eRF1. Более того, в агрегаты Sup35p может21включаться и Sup45p (eRF1) (Paushkin et al., 1997). Следом за этим падаетэффективностьтерминациипреждевременноготрансляции,стоп-кодонакакавероятностьзначащегораспознавания(эффективностьнонсенс-супрессии) увеличивается (Рис. 1) (см.

обзор (Serio et al., 1999b)). Воснове этого феномена лежит возможность взаимодействия со стоп-кодономнекоторых тРНК. Например, так называемые супрессорные тРНК могутсвязываться с одним из нонсенс-триплетов благодаря нуклеотидным заменам вантикодоне (см. обзор (Inge-Vechtomov et al., 2003)). Кроме того, стоп-кодон,согласно гипотезе качания (wobble-гипотеза) (Crick, 1966), может быть распознаннекоторыми тРНК, не содержащими мутаций. Таким образом, за взаимодействие сстоп-кодоном в ходе белкового синтеза конкурируют, с одной стороны, комплексeRF1 и eRF3, а с другой, тРНК, способные с ним взаимодействовать (см. обзор(Inge-Vechtomov et al., 2003)).3.4.

«Жизненный цикл» [PSI+]В данном разделе будут рассмотрены процессы, связанные с возникновением,поддержанием и исчезновением фактора [PSI+] в клетках дрожжей, что можнопредставить как своеобразный «жизненный цикл» приона. Спонтанное появление[PSI+] – это довольно редкое событие (5,8 х 10-7) (Chernoff et al., 1993; Derkatch etal., 1997; Lancaster et al., 2010). С гораздо более высокой частотой прионпоявляется при сверхэкспрессии гена SUP35 ( > 0,2) (Chernoff et al., 1993) или егоукороченных фрагментов (Derkatch et al., 1996; Kochneva-Pervukhova et al., 1998b).В течение первых нескольких часов сверхпродукции белка на периферии клеткиобразуется один крупный агрегат, обычно в виде кольца (Zhou et al., 2001),который на этом этапе состоит из протяженных фибрилл (Tyedmers et al., 2010).Затем его локализация меняется, он перемещается в район вакуоли (Ganusova etal., 2006).

При последующих делениях крупные агрегаты остаются в материнскихклетках, а в почки попадают только более мелкие олигомеры (Mathur et al., 2010).Они представляют собой «семена» стабильного [PSI+], которые уже неассоциированы с цитоскелетом (Ganusova et al., 2006). Сверхэкспрессия SUP35 не22Рисунок 1. Последствия возникновения [PSI+] в клетках S. cerevisiae. В нативнойконформации Sup35p в комплексе с Sup45p участвует в процессах распознавания стоп-кодона изавершении белкового синтеза (А). Появление нонсенс-мутации в гене приводит к отсутствиюсоответствующего белка (Б). Появление фактора [PSI+] приводит к инактивации части Sup35p ввиде амилоидных агрегатов, что является причиной снижения эффективности терминациитрансляции.

В результате эти события приводят к нонсенс-супрессии и синтезуфункционального белка в клетках [PSI+] (В), но не [psi-] (Б). Рисунок автора.23всегда приводит к появлению приона, зачастую появляются ненаследуемыеагрегаты Sup35p, которые исчезают после снижения количества Sup35p в клетке(Salnikova et al., 2005; Kushnirov et al., 2007).В системе in vitro процесс формирования фибрилл Sup35p de novo состоит издвух этапов. Первый — наиболее медленный, в ходе него сначала появляютсянеструктурированные мицелиальные агрегаты Sup35p, которые впоследствиидают начало «ядру» для последующей полимеризации фибриллы. Второй этап —быстрый, он включает в себя процесс присоединения мономерного белка ксформированному «ядру» (Serio, 2000).Как уже было отмечено, активную роль в формировании прионных агрегатовSup35p и их транспортировке играют различные компоненты актиновогоцитоскелета.