Диссертация (Влияние мутаций в прионизующем домене белка sup35 на свойства приона [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae), страница 7

Этотучасток играет роль в поддержании фактора [PSI+]: при его отсутствии прионстановится нечувствительным к сверхпродукции Hsp104p (Helsen et al., 2012).Фрагмент M­домена Sup35p 124­137 а.к. необходим для поддержания некоторыхвариантов приона (Bradley et al., 2004), а полная делеция этого домена уменьшаетстабильность [PSI+] в ходе клеточных делений (Liu et al., 2002). Для поддержания [PSI+] наиболее значимым является N-домен Sup35p, вотсутствии которого прион не может существовать (Ter-Avanesyan et al., 1994).

Сэтой точки зрения стоит отметить необычный аминокислотный состав этогодомена: он обогащен большим количеством аспарагиновых и глутаминовыхостатков (более 55 %) (регион NQ на Рис. 4) (Kushnirov et al., 1988), чтохарактерно и для других прионов (см. обзор (Liebman et al., 2012)). Помимо этого,N-концевой участок содержит один неполный и пять полных несовершенныхповторов, состоящих из 9 аминокислотных остатков (QGGYQQYNP) (Kushnirov et33al., 1988).

От наличия этих элементов зависит способность Sup35p переходить вприонную конформацию (Liu et al., 1999; Parham et al., 2001; Osherovich et al.,2004; Shkundina et al., 2006).Рисунок 4. Структура Sup35p. Числа соответствуют номерам аминокислотных остатков,ограничивающих основные участки белка. NQ — район обогащенный остатками аргинина иглутамина; NR — район олигопептидных повторов (модифицировано из обзора (Шкундина идр., 2006)).Минимальным фрагментом Sup35p, который может поддерживать прион,является участок с 1 по 64 аминокислоту.

Он включает в себя весь глутамин- иаспарагин-богатый район и первые два олигопептидных повтора (Liu et al., 1999;Osherovich et al., 2004; Shkundina et al., 2006). Более короткий фрагмент 1-57 а.к.(отсутствует часть второго повтора) сохраняет только способность к агрегации ииндукции [PSI+], но уже с пониженной частотой (Osherovich et al., 2004).Укороченные варианты Sup35p (1-61 а.к.) сохраняют способность образовыватьагрегаты in vitro, которые способны индуцировать прион при белковойтрансформации (King et al., 2004).Участок олигопептидных повторов белка Sup35 имеет особое значение дляподдержания [PSI+]. Увеличение их количества способствует более интенсивнойагрегации белка.

Делеция практически всех повторов (с 2-го по 5-ый) имеет прямопротивоположный эффект (Liu et al., 1999). Уменьшение числа повторовоказывает влияние на фрагментацию прионных агрегатов. Это позволяетпредположить, что участок олигопептидных повторов вовлечен в этот процесс инеобходим для правильной работы Hsp104p (Shkundina et al., 2006).

При этомQN-регион необходим для формирования агрегатов (Osherovich et al., 2004).В   совокупности   эти   данные   свидетельствуют   о   том,   что   N­   и   M­доменыSup35p   обладают   определенными   функциями   и   играют   значительную   роль   вподдержании фактора [PSI+].343.7. Мутации в гене SUP35, влияющие на стабильность фактора[PSI+]Мутации типа PNM (от [PSI+] no more), которые приводили к потере фактора[PSI+], были описаны еще до доказательства прионной природы этого агента(McCready et al., 1977).

Одной из первых картированных мутаций стала PNM2,приводящая к замене глицина на аспарагиновую кислоту в 58-м положении. Этамутация вызывала полную потерю приона уже через несколько делений даже вприсутствии аллели SUP35 дикого типа (Doel et al., 1994). При последующемболее детальном исследовании было показано, что сверхэкспрессия PNM2 можетприводить к индукции приона de novo (Kochneva-Pervukhova et al., 1998a). Эффектэтой мутации зависит от штамма [PSI+].

В случае сильного варианта аллельприводила к снижению уровня нонсенс-супрессии. На фоне слабого штамма этотпоказатель увеличивался, и вместе с этим возрастала митотическая стабильностьприона (Derkatch et al., 1999). Этот парадокс объясняется тем, что Sup35p сзаменой G58D при включении в агрегат способствует его фрагментациишаперонами. Благодаря этому слабые варианты приона стабилизируются, асильные исчезают из-за полного растворения фибрилл Sup35p (DiSalvo et al.,2011). Эффект мутации PNM2 также зависит от того, какой фрагмент Sup35pвовлечен в формирование структуры прионных агрегатов.

Если этот участок невключает в себя 58-го а.к., то потеря приона под действием PNM2 связана снарушением сегрегации [PSI+] в дочерние клетки. Сама мутация оказываетнезначительное влияние на свойства агрегатов Sup35p (Verges et al., 2011), хотя подругим данным PNM2 может значительно менять конформацию полипептида,соответствующего второму олигопептидному повтору Sup35p (Marchante et al.,2013). Мутация PNM1 также приводит к потере приона, но в отличие от PNM2,снижает эффективность фрагментации агрегатов Sup35p (DiSalvo et al., 2011).На данный момент описано большое количество мутаций sup35, влияющихна стабильность приона (Табл.

2) (Doel et al., 1994; DePace et al., 1998; King, 2001).Важно отметить, что в большинстве случаев — это замены полярных35аминокислот на заряженные, а также то, что все они локализуются в пределахрегиона Sup35p, необходимого для поддержания [PSI+] (с 1 по 64 а.к.) (TerAvanesyan et al., 1994; Osherovich et al., 2004).

Это подтверждает высокуюзначимость этого участка для сохранения приона. Тем не менее, в C-доменеSup35p также были обнаружены миссенс-мутации (T314A или Т314D), которыеприводят к потере фактора [PSI+]. Эти замены замедляют процесс формированияагрегатов Sup35p in vitro, а также не могут поддерживать прион in vivo. Учитываяэти данные, нельзя исключить, что C-домен Sup35p также оказывает влияние настабильность приона [PSI+] (Kabani et al., 2011).Таблица 2. Влияние мутантных аллелей на фенотип штаммов, несущих фактор [PSI+](модифицировано из (Zhouravleva et al., 2002)) *1 ­ (Doel et al., 1994); *2 ­ (King, 2001); *3 ­ (DePaceet al., 1998).ЗаменаSup35-PNM2 (G58D)*1G7D*2N12K*2Q15R*2S17R*2G20D*2G25D*2G44R*2G54E*2G58N*2G58S*2N8D*3N8S*3N9K, Q24R, двойная замена*3Q10R, Q91L, двойная замена*3N12D*3Q14R*3Q15R*3Фенотипические эффектымутантного белкаПотеря [PSI+]АнтисупрессияАнтисупрессияАнтисупрессияАнтисупрессияАнтисупрессияАнтисупрессияПотеря [PSI+]АнтисупрессияАнтисупрессияАнтисупрессияАнтисупрессияАнтисупрессияПотеря [PSI+]Потеря [PSI+]АнтисупрессияАнтисупрессияАнтисупрессияВ завершение этого раздела необходимо еще раз подчеркнуть, что эффектырассмотренных мутаций специфичны по отношению к конкретному вариантуприона (Derkatch et al., 1999; King, 2001; Lin et al., 2011) и в некоторых случаяхзависят от структурной организации прионных агрегатов Sup35p (Verges et al.,2011).363.8.

Межвидовой барьер для передачи приона [PSI+]Феномен «межвидового барьера» для передачи прионов впервые былобнаружен на примере PrP. Этот прион, выделенный из одного вида, крайне редкомог передаваться представителям другого вида. Если же это случалось, тоинкубационный период заболевания был очень продолжительным. Наличиемежвидового барьера связано с различиями в последовательности белка PrP уразных видов (см. обзор (Prusiner, 1998)). Это же явление характерно и дляприонов низших эукариот, в частности, [PSI+] (Kushnirov et al., 2000a; Santoso etal., 2000). N-домен белка Sup35 необходим для поддержания [PSI+] (Ter-Avanesyanet al., 1994) и является высоко вариабельным среди представителей разных видов,что во многом определяет барьер для передачи приона между ними (Kushnirov etal., 2000a; Santoso et al., 2000).

Белки, состоящие из аминоконцевых участковSup35p Pichia metanolica или Candida albicans и C-домена S. cerevisiae, могутиндуцировать и поддерживать фактор [PSI+]. Тем не менее, их сверхпродукция неприводит к прионизации Sup35p S. cerevisiae (Kushnirov et al., 2000a; Santoso et al.,2000).Химерный Sup35p, N-домен которого состоит из фрагментов Sup35p разныхвидов (часть белка S.

cerevisiae с 1 по 39 а.к., слитая с 40-140 а.к. C. аlbicans),может индуцировать появление двух разных вариантов приона. При этом каждыйиз них способен прионизовать только определенный Sup35p (либо S. cerevisiae,либо C. albicans) (Chien et al., 2001). Барьер для передачи [PSI+], поддерживаемоготакой химерной конструкцией, может быть искусственно создан, если ввести вбелок определенные замены.

Если они будут затрагивать первые 40 аминокислот,то белок потеряет способность прионизовать eRF3 S. cerevisiae, но не C. albicans.Замены, локализованные в участке с 40 по 140 а.к., приводят к противоположнымэффектам (Chien et al., 2003). В обсуждаемом химерном Sup35p описаны дванеперекрывающихсяКонформационныйучастка,переходкоторыеодногоизмогутнихформироватьпрепятствуетамилоиды.аналогичномупревращению другого, и тем самым определяет свойства приона (Foo et al., 2011).37В пределах этих регионов также локализуются небольшие последовательности,которые непосредственно отвечают за прионизацию мономерного белка (Tessier etal., 2007). Специфичность вариантов приона, образованных химерным Sup35p,определяется тем, какая из этих двух последовательностей (характерная дляS.