Диссертация (Влияние мутаций в прионизующем домене белка sup35 на свойства приона [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae), страница 9

AmpR, URA3, LEU2 и SUP35 —обозначения соответствующих генов на плазмиде. HindIII, XhoI и PstI указывают нарасположение сайтов рестрикции.Для получения векторов pET21b-SUP35NM, несущих мутации sup35KK, атакжеCEN-GAL-sup35-M1иCEN-GAL-sup35-M2,использовалисайт-направленный мутагенез на плазмиде (см. раздел «Сайт-направленныймутагенез»).

После окончания реакции добавляли избыток рестриктазы DpnI(«Fermentas») (3 мкл, 10 ед. акт./мкл). Этот фермент разрезает метилированнуюДНК, в данном случае исходную плазмидную ДНК без мутации, которая служила44матрицей. Полученными линеаризованными плазмидами трансформировалибактерии. Наличие мутации проверяли секвенированием.Таблица 3. Плазмиды, использованные в работе.НазваниеМаркерыПромотор КонструкцияИсточникpRSU1AmpR, LEU2PSUP35SUP35(Volkov et al., 2002)pRSU1-sup35-M1AmpR, LEU2PSUP35sup35-M1ПолученаработеpRSU1-sup35-M2AmpR, LEU2PSUP35sup35-M2pRSU1-sup35-M3AmpR, LEU2PSUP35sup35-M3ПредоставленыВ.В.

ЩепачевымpRSU1-sup35-M4AmpR, LEU2PSUP35sup35-M4pRSU1-sup35-M5AmpR, LEU2PSUP35sup35-M5pRSU2AmpR, URA3PSUP35SUP35(Volkov et al., 2002)pRSU2-sup35-M1AmpR, URA3PSUP35sup35-M1ПолученаработеpRSU2-sup35-M2AmpR, URA3PSUP35sup35-M2pRSU2-sup35-M3AmpR, URA3PSUP35sup35-M3ПредоставленыВ.В. ЩепачевымpRSU2-sup35-M4AmpR, URA3PSUP35sup35-M4pRSU2-sup35-M5AmpR, URA3PSUP35sup35-M5pRS316AmpR, URA3--ATCC biologicalresource centerCEN-GAL-SUP35(pVK71)AmpR, URA3PCYCl-GALSUP35(Derkatch1996)etal.,CEN-GAL-sup35-M1AmpR, URA3PCYCl-GALsup35-M1вэтойCEN-GAL-sup35-M2AmpR, URA3PCYCl-GALsup35-M2ПолученыработеpET21b-SUP35NMAmpRT7SUP35NM-(His)6pET21b-sup35NM-M1AmpRT7pET21b-sup35NM-M2AmpRT7sup35NM-M1-(His)6 Полученыsup35NM-M2-(His) работеpET21b-sup35NM-M3AmpRT7sup35NM-M3-(His)6pET21b-sup35NM-M4AmpRT7sup35NM-M4-(His)6pET21b-sup35NM-M5AmpRT7sup35NM-M5-(His)6pRS315-SUP35-3HAAmpR, LEU2PSUP35SUP35-3HA(Afanasieva2011)WTAmpR, URA3PPGKPGK-lacZ(Wang et al., 2001)UAAAmpR, URA3PPGKPGK-(UAA )-lacZUAGAmpR, URA3PPGKPGK-(UAG)-lacZUGAAmpR, URA3PPGKPGK-(UGA)-lacZвэтойвэтойПредоставленаГ.А.

Журавлевойвэтой6etal.,455.2. ШтаммыДля наработки плазмид был использован штамм DH5α Escherichia coli (F–Φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rK–, mK+) phoA supE44λ– thi-1 gyrA96 relA1). Для сверхпродукции гетерологичных белков использовалиштамм BL21 E. coli (fhuA2 [lon] ompT gal [dcm] ΔhsdS) (Sambrook et al., 1989).Штаммы 10-7A-D832 и 7A-D832 дрожжей S. cerevisiae были предоставленыА.С. Борхсениусом; их генотипы представлены в таблице 4. Они являютсяизогенными и отличаются только наличием приона [PSI+].

Оба штамма несутделецию SUP35, компенсируемую копией гена на плазмиде, а также содержатнонсенс-мутацию ade1-14 (UAG) и мутации в генах биосинтеза лейцина иурацила.Штаммы 9-10-7A-D832 и 9-7A-D832 получены в ходе работы (Табл. 4), ониотличаются от своих предшественников наличием делеции гена RNQ1. Штаммы[PSI+] и [psi-] трансформировали линейным фрагментом ДНК, содержащем генустойчивости к канамицину (KanMX), фланкированный последовательностями,комплементарными гену RNQ1.

В клетках дрожжей этот фрагмент благодарямеханизму гомологичной рекомбинации может встраиваться в геном, прерываяпоследовательность гена RNQ1. Трансформантов, несущих вставку, отбирали поустойчивости к канамицину. Специфичность вставки проверяли с помощью ПЦРс геномной ДНК трансформантов (условия реакции и праймеры приведены вразделе «Амплификация ДНК для получения и проверки штаммов с делецией генаRNQ1»). Поскольку Rnq1p является структурным белком фактора [PIN+], делециягена RNQ1 повлекла за собой потерю этого приона.Штаммы OT56([PSI+]s) и OT55([PSI+]w) (изогенные производные от 74-D694(Chernoff et al., 1995)) были предоставлены Ю.О. Черновым, а субклоны OT56([PSI+]nss1,[PSI+]nss2) — А.Г.

Матвеенко.46Таблица 4. Штаммы дрожжей S. cerevisiae, использованные в работе.ШтаммГенотип10-7А-D832MAT α ade1-14 his7-1 leu2 lys2 trp1 ura3 SUP35::TRP1 [pYCM-U2-SUP35][PSI+][PIN+]7А-D832MAT α ade1-14 his7-1 leu2 lys2 trp1 ura3 SUP35::TRP1 [pYCM-U2-SUP35][psi-] [PIN+]9-10-7А-D832MAT α ade1-14 his7-1 leu2 lys2 trp1 ura3 SUP35::TRP1 RNQ1::KanMX[pYCM-U2-SUP35] [PSI+] [pin-]9-7А-D832MAT α ade1-14 his7-1 leu2 lys2 trp1 ura3 SUP35::TRP1 RNQ1::KanMX[pYCM-U2-SUP35] [psi-] [pin-]OT56MAT α ade1-14 his3Δ-200 leu2-3,112 trp1-289 ura3-52 [PSI+]s [PIN+]OT55MAT α ade1-14 his3Δ-200 leu2-3,112 trp1-289 ura3-52 [PSI+]w[PIN+]5.3. Среды и условия культивированияПриработесдрожжевымиштаммамииспользовалистандартныекультуральные среды: полную среду (YPD), минимальную среду (MD),синтетическую среду (SC), а также их производные — селективные среды, несодержащие отдельных компонентов среды SC или MD.

Для получения твердыхсред добавляли агар из расчета 25 г/л среды. Для потери плазмид c маркеромURA3 использовали среду с 5-ФОК (5-фтороротовая кислота) в концентрации1 г/л. При приготовлении среды для индукции галактозного промотора вместоглюкозы добавляли эквивалентные количества галактозы и рафинозы (Kaiser et al.,1994).Присутствие приона [PSI+] оценивали по способности клеток дрожжейсупрессировать мутацию ade1-14 (UGA), то есть расти на среде без аденина(−Ade), а также белому цвету колоний на MD 1/5 Ade (Kaiser et al., 1994) и1/4 YEPD (Eaglestone et al., 2000). Колонии клеток [psi-] характеризовалиськрасным цветом и не были способны расти на среде без аденина.

Для изгнанияприона [PSI+] из клеток использовали среду YPD с ГГХ в концентрации 4-5 мM(Tuite et al., 1981).Для выращивания бактерий использовали полную среду (LB). Селекциюустойчивых к ампициллину трансформантов проводили на среде LB, содержащей47ампициллин в концентрации 100 мкг/мл (Sambrook et al., 1989). Для получениябольшого количества биомассы использовали среду 2TY или ее производную сдобавлением ампициллина (2TYa) (O’Brien et al., 2001).Штаммы дрожжей инкубировали при температуре 30оС, штаммы бактерий при 37оС. При выращивании в жидкой среде культуры дрожжей перемешивали соскоростью 200 оборотов/мин, культуры бактерий — 250-300 оборотов/мин(Sambrook et al., 1989; Kaiser et al., 1994).5.4.

Генетические методыВ работе использовали стандартные методики генетики дрожжей S. cerevisiae,а также методы работы с бактериальными культурами, описанные в литературе(Sambrook et al., 1989; Kaiser et al., 1994).5.4.1. Высокоэффективная дрожжевая трансформацияМетодика (Kaiser et al., 1994) была незначительно модифицирована. Ночнуюкультуру дрожжей разводили в свежей среде (50 мл) до концентрации106 клеток/мл.Клеткиинкубировалипримерно3часанаскорости200 оборотов/мин и 30оС до достижения концентрации 2 х 107 клеток/мл.

Затемклеткисобиралиспомощьюцентрифугированиянаскорости3000-5000 оборотов/мин в течение 5 минут. Получившийся осадок промываливодой и 100 мМ ацетатом лития (ресуспендировали, а затем осаждали при тех жеусловиях). После этого клетки ресуспендировали в 0,5 мл 100 мМ ацетата лития иинкубировали полчаса при 25оС. Затем суспензию центрифугировали, большуючасть жидкости удаляли. Полученные клетки использовали для трансформации,их разделяли по необходимому количеству эппендорфов, в которые добавлялиостальные компоненты реакции: 240 мкл ПЭГ (полиэтиленгликоль) (50% w/v),36 мкл 1 М ацетата лития, 25 мкл балластной ДНК (2 мг/мл), 1 мкл плазмиды(1,5 мкг) и воду до конечного объема в 360 мкл.

Смесь тщательно перемешивали иинкубировали в течение 30 минут при 25 оС. Затем переносили ее в водяную банюна 42оС на 12 минут. После этого клетки осаждали центрифугированием на48скорости 5000 оборотов/мин в течение 15 секунд. Осадок ресуспендировали в100 мкл стерильной дистиллированной воды и высевали их на твердуюселективную среду.

Через несколько дней отбирали трансформантов.5.4.2. Выделение геномной ДНК дрожжей S. сerevisiaeДля выделения геномной ДНК дрожжей S. cerevisiae использовали ренееописанную методику с незначительными изменениями (Kaiser et al., 1994). Длявыделения ДНК клетки осаждали из 3-6 мл ночной культуры с помощьюцентрифугирования на скорости 9000 оборотов/минуту в течении 60 секунд.Удаляли излишки среды, к осадку клеток добавляли 250 мкл раствора сорбитола сЭДТА ((0.9 M сорбитол и 0.1 M ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота)) и15 мкл зимолиазы 70Т.