Диссертация (Влияние мутаций в прионизующем домене белка sup35 на свойства приона [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae), страница 8

cerevisiae или C. albicans) экспонирована на конце амилоида (Foo et al., 2011;Marcelino-Cruz et al., 2011).В системе in vitro были получены фибриллы Sup35NMp S. cerevisiae, которыеускоряли полимеризацию аналогичного белка C. аlbicans. Трансформация этимифибрилламиклеток[psi-],несущихSUP35C. аlbicans,приводилаквозникновению [PSI+]. При этом важно отметить, что в данном случае отсутствиемежвидового барьера было связано с конкретной конформацией Sup35NMp, а не сего аминокислотной последовательностью (Tanaka et al., 2005).Межвидовой барьер при передаче [PSI+] был описан и для болееблизкородственных видов дрожжей, представителей рода Saccharomyces.

БелкиSup35p разных представителей этой группы могут индуцировать и поддерживать[PSI+] (Chen et al., 2007); то же самое относится к химерным конструкциям,состоящим из MC-домена Sup35p S. cerevisiae, слитого с N-доменом другого вида(Afanasieva et al., 2011). В отличие от описанного выше барьера междуS. cerevisiae и C. аlbicans, в случае близкородственных видов гетерологичныеSup35p могут коагрегировать в клетках [PSI+], хотя при определенных сочетанияхэтого не происходит. В то же время прион зачастую теряется при замене SUP35S.

cerevisiae на ген близкородственного вида (Chen et al., 2007; Afanasieva et al.,2011). Последствия передачи [PSI+] с одной аллели SUP35 на другую зависят отштамма приона (Chen et al., 2010; Afanasieva et al., 2011), и, возможно,определяются структурными особенностями агрегатов. Для объяснения этогоявленияпредполагаютразличныемеханизмы:отсутствиекоагрегациигетерологичных белков, блокирование полимеризации фибрилл, образованиененаследуемых амилоидов (Afanasieva et al., 2011).Даже с учетом большого объема накопленных данных явление межвидового38барьера все еще представляет большой интерес для исследователей. Этот феноменпозволил выявить различные молекулярные механизмы, которые в совокупностиопределяют возможность или невозможность формирования приона.3.9. Модели структурной организации агрегатов Sup35pВ дрожжевых клетках [PSI+] белок Sup35 образует агрегаты, которые могутбыть визуализированы in vivo при помощи конструкций, состоящих из SUP35,слитого с геном GFP.

На препаратах штаммов, несущих прион в присутствиитакой конструкции, детектируются фокусы флуоресценции,отсутствующие вклетках [psi-]. Это свидетельствует о том, что химерные белки включаются вагрегаты, обеспечивая тем самым высокую локальную концентрацию GFP и, какследствие, фокусы свечения (Patino et al., 1996). In vitro Sup35p или его N-доменформируют неразветвленные фибриллы (Glover et al., 1997; King et al., 1997). Поданным спектрального анализа полученные агрегаты Sup35p имели высокоупорядоченную структуру, обогащенную β-слоями, и окрашивались КонгоКрасным.

На основании этих данных было сделано предположение, что агрегатыSup35p являются амилоидами (Glover et al., 1997; King et al., 1997).Исследование структурной организации амилоидов на атомарном уровнесвязаносбольшимколичествомтрудностей.Впервуюочередьэтоневозможность применения классических методов рентгеноструктурного анализаиспектроскопииядерногомагнитногорезонанса(ЯМР),посколькусоответствующие белки склонны к образованию крупных агрегатов, которые немогут быть кристаллизованы.

Тем не менее, с помощью методов просвечивающейэлектронной микроскопии, твердофазной спектроскопии ЯМР, а также методов наоснове электронного парамагнитного резонанса удается получать данные онекоторых особенностях структуры амилоидов. На основании этих исследованийбыли сформулированы различные модели, описывающие укладку белковыхмолекул в составе таких агрегатов (см. обзор (Shewmaker et al., 2011)).Для объяснения структуры агрегатов [PSI+] с точки зрения ориентациимолекул в было предложено две модели: β-спирали и супер-складчатой39β-структуры(Рис.5).Согласнопервойизних,β-слои,образованныеприонизованными N-концевыми участками Sup35p, укладываются по спирали,при этом образуются полые цилиндры (Рис. 5Б) (Kishimoto et al., 2004).Отдельные мономеры при этом стыкуются в фибриллу по типу «голова к голове,хвост к хвосту», т.

е. через соответствующие крайние регионы N-домена(25-38 а.к. и 91-106 а.к.). Карбокси-терминальные участки при этом не входят вфибриллы (Krishnan et al., 2005).Рисунок 5. Модель супер-складчатой β-структуры (А) β-спирали (Б). Стрелкисимволизируют фрагменты белка, образующие β-слои. Разными цветами обозначены отдельныемолекулы белка в составе агрегата.Согласно второй модели, в составе агрегатов N-домены белка Sup35 уложеныв параллельную супер-складчатую β-структуру (Kajava et al., 2004).

В этом случаеβ-слои, во-первых, ориентированы перпендикулярно оси фибриллы, вследствиечего образуется стопка из плоских молекул. Во-вторых, отдельные мономерысвязаны между собой водородными связями, ориентированными параллельно осивсего агрегата. И, в-третьих, эти связи образуются междуполярнымиаминокислотами, находящимися «в регистре», т. е. в одинаковых положениях вбелке (Рис. 5А). При этом заряженные аминокислотные остатки вытесняются врегионы «поворотов», что обеспечивает дополнительную стабилизацию системыблагодаря снижению ее свободной энергии.

Близкая локализация этих остатков вобласти β-слоев приводила бы к дестабилизации всей структуры из-завозникновения электрических взаимодействий между одноименными зарядами(Kajava et al., 2004).40На сегодняшний день модель супер-складчатой β-структуры считаетсядоказанной для агрегатов Sup35p.

В ее пользу свидетельствуют нижеследующиеданные. Анализ дифракции рентгеновских лучей при прохождении через растворолигопептида (GNNQQNY), соответствующего фрагменту N-домена Sup35p(7-13 а.к.) демонстрирует, что эти молекулы образуют кросс β-структуру.Последнее означает, что β-слои в образующейся фибрилле ориентированыперпендикулярно ее оси (Nelson et al., 2005). Согласно модели супер-складчатойβ-структуры, основную роль в поддержании приона [PSI+] играет состав, а неконкретная последовательность аминокислот. Подтверждением этому является то,что прионформирующий домен Sup35p с «перетасованной» последовательностьюспособен поддерживать [PSI+] (Ross et al., 2005).

В составе прионных агрегатовтолько одна молекула белка образует один β-серпантин (Diaz-Avalos et al., 2005), арасстояние между одинаковыми аминокислотами Sup35p в составе агрегатовсоставляет порядка 5 Å, что соответствует расстоянию между β-листами. Этотфактсталсущественнымподтверждениемсупер-складчатойβ-структуры(Shewmaker et al., 2006; Shewmaker et al., 2011).Модель параллельной супер-складчатой β-структуры согласуется также с ужеимеющимися данными по мутагенезу. Согласно этой модели именно заменыполярных аминокислот на заряженные приводят к дестабилизации приона (Doel etal., 1994; DePace et al., 1998; King, 2001).

В качестве наиболее яркого примераможно привести аллель PNM2, характеризующуюся появлением в молекулеSup35p заряженной аспарагиновой кислоты (Doel et al., 1994), и, как следствие,приводящую к потере приона. Модель супер-складчатой β-структуры такжеобъясняет возможность существования большого количества вариантов приона[PSI+]. Согласно ее положениям, Sup35p может образовывать множестворазличных конформаций, которые могут отличаться по своим свойствам (Kajava etal., 2004).413.10.

ЗаключениеНесмотря на многочисленные успехи в исследованиях структуры амилоидов,многое в этом вопросе остается непонятным. В особенности это относится кживым клеткам, поскольку все биофизические методы, используемые в этойобласти, могут быть использованы только in vitro. Мутационный анализ насегодняшний день остается одним из немногочисленных методов, позволяющихизучать особенности организации прионных агрегатов in vivo. Прион [PSI+]благодаря продолжительной истории его изучения, является удобной моделью длятаких исследований.Основываясь на том, что прионные агрегаты Sup35p имеют супер-складчатуюβ-структуру,былсоздан(sup35-M1 (YQ46-47KK),sup35-M4(QQ80-81KK),набормутантныхsup35-M2 (QQ61-62KK),sup35-M5 (QQ89-90KK)).аллелейSUP35sup35-M3 (QQ70-71KK),Согласнотеоретическимпредпосылкам, эти замены несовместимы с фактором [PSI+].

В ходе исследованиямы проверили эту гипотезу и на практике выявили эффекты этих мутаций, а такжеохарактеризовали соответствующие молекулярные механизмы.424. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИЦель работы: идентификация молекулярных механизмов, лежащих в основеизменения свойств приона [PSI+] под влиянием мутаций в N-домене Sup35p.В рамках данной цели были сформулированы следующие задачи:• характеристика влияния мутаций sup35KK на свойства приона [PSI+];• изучение влияния комбинаций мутаций sup35KK на стабильность приона[PSI+];• проверка влияния мутаций sup35KK на различные варианты приона [PSI+];• исследование зависимости эффектов мутаций sup35KK от [PIN+]-статусаклеток;• характеристика фибрилл, образованных мутантными белками in vitro.435. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ5.1.

ПлазмидыПлазмиды,использованныевработе,перечисленывтаблице3.Центромерные плазмиды pRSU1 и pRSU2 (Рис. 6) (Volkov et al., 2002), несущиемутациюsup35-M1(YQ46-47KK),былиполученысайт-направленныммутагенезом на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). В ходе двухпоследовательных ПЦР (праймеры и условия реакций приведены в разделе«Сайт-направленный мутагенез») синтезировали линейный фрагмент ДНК,соответствующий гену SUP35, но несущий интересующие нас замены (Рис. 7).Затем ПЦР-продукт клонировали в плазмиду pRSU1 или pRSU2 по сайтамрестрикции HindIII.

Ориентацию вставки проверяли с помощью рестрикции XhoIи PstI. Наличие мутации проверяли секвенированием. В ходе работы былиполучены плазмиды с мутацией sup35-M1. Остальные векторы серий pRSU1 иpRSU2, содержащие мутации sup35-M2-sup35-M5, сконструированы ранее внашей лаборатории В.В. Щепачевым.Рисунок 6. Физическая карта плазмид pRSU1 и pRSU2.