Диссертация (Влияние мутаций в прионизующем домене белка sup35 на свойства приона [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae)
Описание файла
Файл "Диссертация" внутри архива находится в папке "Влияние мутаций в прионизующем домене белка sup35 на свойства приона [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae". PDF-файл из архива "Влияние мутаций в прионизующем домене белка sup35 на свойства приона [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "биология" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве СПбГУ. Не смотря на прямую связь этого архива с СПбГУ, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата биологических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст из PDF
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТБИОЛОГО-ПОЧВЕННЫЙ ФАКУЛЬТЕТКАФЕДРА ГЕНЕТИКИ И БИОТЕХНОЛОГИИНа правах рукописиБондарев Станислав АлександровичВЛИЯНИЕ МУТАЦИЙ В ПРИОНИЗУЮЩЕМ ДОМЕНЕ БЕЛКА Sup35НА СВОЙСТВА ПРИОНА [PSI+] ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisiaeСпециальность 03.02.07 – генетика.Диссертацияна соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучный руководительд.б.н., профессор, Г.А. ЖуравлеваСанкт-Петербург20142Оглавление1. Список сокращений.....................................................................................................62. Введение.......................................................................................................................83. Обзор литературы......................................................................................................103.1.
Прионы и амилоиды...........................................................................................103.1.1. Прионы и амилоиды высших эукариот.....................................................103.1.2. Прионы и амилоиды низших эукариот......................................................143.1.3. Амилоиды прокариот..................................................................................173.2. Краткая история исследований фактора [PSI+]................................................183.3. [PSI+] и терминация трансляции.......................................................................193.4. «Жизненный цикл» [PSI+]..................................................................................213.5.
Варианты приона [PSI+].....................................................................................283.6. Структура белка Sup35.......................................................................................313.7. Мутации в гене SUP35, влияющие на стабильность фактора [PSI+].............343.8. Межвидовой барьер для передачи приона [PSI+]............................................363.9. Модели структурной организации агрегатов Sup35p......................................383.10. Заключение........................................................................................................414. Цель и задачи.............................................................................................................425.
Материалы и методы.................................................................................................435.1. Плазмиды.............................................................................................................435.2. Штаммы...............................................................................................................455.3. Среды и условия культивирования...................................................................465.4. Генетические методы.........................................................................................475.4.1. Высокоэффективная дрожжевая трансформация.....................................475.4.2. Выделение геномной ДНК дрожжей S.
сerevisiae....................................485.4.3. Оценка митотической стабильности приона [PSI+]..................................485.4.4. Оценка передачи и потери приона [PSI+]..................................................495.4.5. Подсчет количества пропагонов.................................................................495.4.6. Оценка эффективности нонсенс-супрессии..............................................4935.5. Молекулярно-биологические методы...............................................................505.5.1. Сайт-направленный мутагенез...................................................................505.5.2.
Амплификация ДНК для получения и проверки штаммов с делециейгена RNQ1...............................................................................................................525.5.3. Денатурирующий электрофорез белков в полиакриламидном геле(SDS-PAGE)............................................................................................................535.5.4. Неспецифическая окраска белков..............................................................545.5.5. Полуденатурирующий электрофорез белков в агарозном геле(SDD-AGE).............................................................................................................545.5.6.
Вестерн-блот гибридизация........................................................................555.5.7. Секвенирование...........................................................................................555.6. Очистка белков из культур E. сoli.....................................................................555.7. Просвечивающая электронная микроскопия...................................................565.8. Цифровая обработка изображений....................................................................575.9. Статистическая обработка.................................................................................576. Результаты..................................................................................................................586.1.
Теоретические предпосылки для создания мутантных аллелей SUP35........586.2. Характеристика влияния мутаций sup35KK на свойства приона [PSI+]..........606.2.1. Мутации PNM2 и sup35-M2 дестабилизируют [PSI+] даже в присутствиигена SUP35 дикого типа........................................................................................606.2.2.
При отсутствии аллели SUP35 дикого типа мутации sup35KK оказваютразличное влияние на свойства и поддержание приона [PSI+].........................636.2.3. Мутации sup35KK не влияют на стабильность белка Sup35p...................656.2.4. Передача и потеря приона в присутствии мутаций sup35KK....................666.2.5. Мутации sup35-M1 и sup35-M2 приводят к исчезновению агрегатовSup35p.....................................................................................................................676.2.6. Белки Sup35-M1 и Sup35-M2 включаются в состав прионных агрегатов[PSI+].......................................................................................................................696.2.7. Мутации sup35-M1 и sup35-M2 могут индуцировать возникновение4приона [PSI+] de novo.............................................................................................706.2.8.
Дестабилизация [PSI+] в присутствии sup35-M2 зависит от количестваклеточных делений................................................................................................716.2.9. Мутации sup35-M3, sup35-M4 и sup35-M5 не влияют на митотическуюстабильность приона [PSI+]..................................................................................736.2.10. Мутации sup35-M4 и sup35-M5 приводят к изменению размераагрегатов Sup35p....................................................................................................746.2.11. Все мутантные аллели незначительно увеличивают стабильностьагрегатов Sup35p при нагревании........................................................................756.2.12.
Мутация sup35-M4 приводит к формированию нового, более«сильного» варианта приона [PSI+]......................................................................776.2.13. Мутация sup35-M5 приводит к уменьшению числа пропагоновв клетке...................................................................................................................786.3. Влияние комбинаций мутаций sup35KK на стабильность приона [PSI+]......806.3.1. Мутации sup35-M2 и sup35-M4 дестабилизируют прион [PSI+] присочетании с другими аллелями sup35KK...............................................................806.3.2.
Дестабилизация [PSI+] в присутствии сочетаний мутаций sup35KKсопровождается увеличением размера агрегатов Sup35p..................................816.3.3. Сочетания мутаций sup35KK модифицируют термостабильностьагрегатов Sup35p....................................................................................................826.4. Зависимость эффектов мутаций sup35KK от варианта приона [PSI+].............836.5. Эффекты мутаций sup35KK не зависят от [PIN+]-статуса клеток....................856.6.
Характеристика фибрилл, образованных мутантными белками in vitro.......867. Обсуждение................................................................................................................927.1. Влияние мутаций sup35-M1 и sup35-M2 на стабильность [PSI+]...................937.2. Влияние мутаций sup35-M3, sup35-M4 и sup35-M5 на свойстваприона [PSI+]..............................................................................................................967.3. Влияние комбинаций мутаций sup35KK на стабильность приона [PSI+]......1007.4. Заключение........................................................................................................10258. Выводы.....................................................................................................................1049.
Список литературы..................................................................................................10510. Благодарности........................................................................................................11861. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ5-ФОК — 5-фтороротовая кислотаа.к. — аминокислотный остатокГГХ — гидрохлорид гуанидинаДМСО — диметилсульфоксидИПТГ — изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидОНПГ — орто-нитрофенил-β-галактозидПЦР — полимеразная цепная реакцияПЭГ — полиэтиленгликольФМСФ – фенилметансульфофторидЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислотаЭПР — электронный парамагнитный резонансЯМР — ядерно-магнитный резонансCARD — caspase-recruitment domain (домен, участвующий во взаимодействии скаспазами)eRF — eukaryotic release factor (эукариотический фактор терминации трансляции)IRF — interferon regulatory factors (факторы, регулирующие синтез интерферонов)GFP — green fluorescent protein (зеленый флуоресцентный белок)NF-κβ — nuclear factor κβ (ядерный фактор κβ, транскрипционный фактор)NMD — nonsense mediated mRNA decay (система деградации мРНК спреждевременными стоп-кодонами в открытой рамке считывания)OR — oligopeptide repeats (олигопептидные повторы)PNM — Psi-no-more (мутации, приводящие к потере приона [PSI+])PrP – prion protein (прионный белок)SDD-AGE—semi-denaturatingdetergentagarosegelelectrophoresis(полуденатурирующий электрофорез в агарозном геле)SDS — sodium dodecyl sulfate (додецил сульфат натрия)SDS-PAGE—sodiumdodecylsulfatepolyacrilamide(денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле)gelelectrophoresis7sup35KK — обозначение аллелей гена SUP35, исследованных в ходе даннойработы: sup35-M1, sup35-М2, sup35-M3, sup35-M4, sup35-M5В работе также использованы стандартные сокращения единиц измерения,общепринятыеобозначениянуклеиновыхкислот,нуклеотидов,атакжекультуральных сред.
