Диссертация (Влияние мутаций в прионизующем домене белка sup35 на свойства приона [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae), страница 2

Названия генов и цитоплазматических факторов, а такжеобозначения фенотипов приведены с учетом правил дрожжевой и бактериальнойноменклатуры.82. ВВЕДЕНИЕПрионами называют инфекционные или наследуемые факторы белковойприроды, механизм распространения которых основан на их способностииндуцировать конформационные изменения определенных полипептидов клетки.Белок в прионной изоформе меняет укладку такого же белка по «своему образу иподобию»,инымисловами,играетрольпространственнойматрицы.Фундаментальный интерес к этому феномену связан с тем, что он представляетсобой новый способ копирования информации, «записанной» в трехмернойструктуре белка.Некоторые прионы являются возбудителями инфекционных заболеваний(Куру, болезнь Крейтсфельдта-Якоба — болезни человека и «почесуха овец»), нозачастую вызывают появление наследуемых черт, которые могут быть адаптивны(прионы низших эукариот).

Появление приона [PSI+] в клетках дрожжейSaccharomyces cerevisiae может приводить как к благоприятным, так ипатологическимпоследствиям.Особенностипроявленияэтогофакторапреимущественно связаны с отличиями в трехмерной укладке белка Sup35p вкаждом конкретном случае. Исследования структуры прионных агрегатов имеханизмов, обеспечивающих их стабилизацию, вызывают большой интерес.

Спрактической точки зрения изучение принципов поддержания прионнойконформации может стать основой разработки лекарственных средств для терапиизаболеваний, которые на сегодняшний день не поддаются лечению.Фактор [PSI+] – это один из наиболее хорошо исследованных прионовдрожжей. Благодаря этому он является удобным «модельным объектом» дляисследования фундаментальных свойств таких детерминантов.

В ходе нашейработы на основании модели супер-складчатой β-структуры, описывающейорганизацию амилоидных агрегатов Sup35p, мы получили набор мутаций sup35KK.Исходя из теоретических предположений, все они должны приводить к потерефактора [PSI+], однако только для двух из пяти аллелей это подтвердилось.Остальные мутации тем или иным образом модифицируют свойства приона или9его агрегатов. Благодаря серии экспериментов in vivo и in vitro мы смоглидоказать, что все исследуемые аллели меняют структуру прионных агрегатов итаким образом влияют на свойства [PSI+]. Также нам удалось выявитьмолекулярные механизмы, лежащие в основе описанных явлений.103.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ3.1. Прионы и амилоиды3.1.1. Прионы и амилоиды высших эукариотВпервые термин «прион» был введен для обозначения инфекционных агентовбелковойприроды,млекопитающих,возбудителейцелогорядаразличныхзаболеванийтаких как Куру, болезнь Крейтсфельдта-Якоба и «почесухаовец» (Prusiner, 1987).

Интерес к этим заболеваниям был вызван общими чертамиих патогенеза: гибелью нейронов и отложением амилоидов (Gajdusek et al., 1957;Hadlow, 1959; Klatzo et al., 1976). Долгое время считалось, что причиной«почесухи овец» является вирус, но данная гипотеза была отвергнута послеэкспериментов,показавшихнечувствительностьвозбудителякнуклеазам(ферментам, гидролизующими нуклеиновые кислоты) (Diener et al., 1982).

Вместес этим был обнаружен ряд других необычных свойств этого патогена, например,устойчивость к денатурирующим агентам (высокой температуре, SDS, мочевине)или ультрафиолету (Alper et al., 1967; Gibbs et al., 1978; Diener et al., 1982). В этовремя была высказана гипотеза, согласно которой инфекционным началомявляется белок, а не нуклеиновая кислота (Griffith, 1967). Это предположениеподвердилось, когда стало очевидно, что многие из упомянутых свойствхарактерны для мембранных белков (Prusiner et al., 1981).

Прион являетсяальтернативной конформацией белка, названного PrP (от Prion Protein), а егоинфекционныеконформационныйсвойствапереходоснованыбелковнасспособноститакойжеиндуцироватьаминокислотнойпоследовательностью (Prusiner, 1982). За этим последовала идентификация PrP, аточнее, фрагмента его амино-терминальной последовательности (Prusiner et al.,1984), а после этого был найден соответствующий ген Prnp (Oesch et al., 1985).Карбокси-терминальный участок PrP образует четыре α-спирали и два β-слоя(Riek et al., 1996).

Амино-терминальный фрагмент не обладает определеннойвторичной структурой, и именно он вовлечен в формирование приона (Prusiner etal., 1984; Riek et al., 1996). В ходе прионизации белок PrP изменяет свою11конформацию, что приводит к формированию большого количества β-слоев (Panet al., 1993). Прион формирующий домен PrP содержит олигопептидные повторы(PHGGGWGQ), число которых коррелирует с развитием прионных заболеваний(Laplanche et al., 1990; Owen et al., 1990; Puckett et al., 1991). Клеточная функцияэтого белка долгое время оставалось неизвестной, и только недавно былавыявлена его роль в поддержании миелиновых оболочек отростков нервныхклеток (Bremer et al., 2010).Амилоиды—этокрупныебелковыеагрегаты,формирующиенеразветвленные фибриллы. Отдельные молекулы белка в составе такихкомплексов образуют многочисленные β-слои, из-за этого они обладают особымидифракционными свойствами.

В то же время, их коровый регион характеризуетсявысокой устойчивостью к протеазам и денатурирующим агентам, а такжезащищен от замещения водорода на дейтерий («H/D exchange») (см. обзор (Baxa,2008)).Амилоиды, как и прионы, изначально были описаны в связи с различнымизаболеваниями: болезнь Альцгеймера (см. обзор (Citron, 2010)), болезньПаркинсона (см. обзор (Alberio et al., 2012)), болезнь Хантингтона (см. обзор(Bano et al., 2011)), диабет второго типа (см. обзор (Baxa, 2008)) и т. д. Это вомногом определило последующее отношение к процессам прионизации иамилоидогенеза.

Зачастую их рассматривают как патологические, хотя на данныймомент постепенно накапливаются данные, свидетельствующие об обратном.Среди примеров адаптивной агрегации белков в клетках млекопитающих являетсяобразованиецитоплазматическихстресс-гранул.Этимногокомпонентные(рибонуклеопротеиновые) комплексы образуются в ответ на стресс, а главной ихфункцией является остановка трансляции (см. обзор (Decker et al., 2012)). Приэтом синтез белков блокируется не полностью: мРНК генов белков тепловогошока не входит в состав стресс-гранул (Nover et al., 1983).

Благодаря этомумеханизму клетка получает возможность перенаправить собственные ресурсы насинтез белков, необходимых для преодоления последствий неблагоприятных12воздействий, а также предотвратить деградацию нетранслированных РНК исохранить их для дальнейшего использования. Кроме этого, предполагаетсяучастие стресс-гранул в сортировке мРНК: некоторые молекулы не покидаюткомплексы в течение всего времени их существования, другие, наоборот,направляются на деградацию или трансляцию (см. обзор (Anderson et al., 2008;Decker et al., 2012)).Ключевыми белками, участвующими в образовании стресс-гранул, являютсяTIA-1 (Gilks et al., 2004) и CPEB (Wilczynska et al., 2005).

Интерес к этимполипептидам связан с тем, что они могут связываться с РНК и способны кприонизации. Последнее, вероятно, необходимо для их участия в образованиистресс-гранул. При удалении прионизующего домена TIA-1 клетка теряетвозможность образовывать соответствующие комплексы при стрессе. Этафункция может восстанавливаться в присутствии химерного белка TIA-1,в котором его прионизующий домен заменен на аналогичный домен из белкаSup35 (структурный белок фактора [PSI+] Saccharomyces cerevisiae) (Gilks et al.,2004). Этот факт также может служить иллюстрацией сохранения определеннойфункциональной агрегации белков у неродственных видов, или же, наоборот,независимого ее появления в ходе эволюции.

В случае белка TIA-1 биологическоезначение его агрегации понятно (образование стресс-гранул), а для Sup35p онопока неизвестно.Белок CPEB, помимо участия в образовании стресс-гранул, вовлечен впроцессы формирования долгосрочной памяти у брюхоногого моллюскаAplysia californica (Si et al., 2010). В нейронах этого организма присутствуют дваварианта CPEB: мономерный и полимерный. Агрегированная форма этого белкадемонстрирует некоторые черты приона и не оказывает какого-либо негативноговлияния на функцию CPEB, т. е.

даже в виде полимеров белок может связыватьРНК. Переход белка из мономерной формы в агрегированную контролируетсясамой клеткой, и это состояние поддерживается более суток за счет прионныхсвойствCPEB.Вэтовремявконкретномнейронеоблегчается13синаптическая передача (Si et al., 2010). Аналогичный механизм описан также и уDrosophila melanogaster, в клетках которой белок Orb2 (гомолог CPEB) такжеучаствует в процессах формирования долгосрочной памяти (Majumdar et al., 2012).Здесь же стоит отметить, что белок CPEB способен к прионизации в клеткахдрожжей S.

cerevisiae (Si et al., 2003).В клетках млекопитающих амилоидные агрегаты белка MAVS формируютсяв ответ на вирусную инфекцию (Onoguchi et al., 2010). Это является ключевымсобытиемвзапускепроникновениявирусареакцийвврожденногоклеткумолекулыиммунногогеликазыответа.RIG-1После(компонентпротивовирусной системы клетки) связываются с РНК вируса, образуя димер. ВрезультатеCARD-домены(caspase-recruitmentdomain)этихбелковубиквитинируются. Образовавшийся комплекс выступает в роли затравки дляполимеризации белка MAVS, имеющего аналогичные CARD-домены. Следуетотметить, что матрица такого рода нужна только в самом начале, затем процесспродолжаетсясампосебе,чтохарактернодлямногихамилоидов.Образовавшиеся агрегаты взаимодействуют с сигнальными белками цитоплазмы,последующий каскад взаимодействий приводит к активации белков IRF (interferonregulatory factors) и NF-κβ (nuclear factor κβ).

В результате запускается синтезинтерферона β (Hou et al., 2011; Wang et al., 2011).Список функциональных амилоидов млекопитающих не ограничиваетсяприведенными выше примерами. К ним также относится белок Pmel17. Вагрегированной форме он участвует в созревании меланосом и процессахполимеризации меланина (Fowler et al., 2006). В виде амилоидных агрегатов могутзапасаться гормоны животных (Maji et al., 2009). Кроме того, у представителейчленистоногих и рыб некоторые белки хориона могут образовывать амилоиды и вагрегированном состоянии входят в состав оболочек яиц (см. обзор (Fowler et al.,2007)), а белок спидроин паука Nephila clavipes в своей амилоидной конформацииявляется основным компонентом паутины (Kenney et al., 2002).143.1.2.