Диссертация (Влияние мутаций в прионизующем домене белка sup35 на свойства приона [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae), страница 10

Смесь инкубировали на водяной бане при температуре37ºC в течение 30 минут. Клетки осаждали на скорости 8000 оборотов/мин иудаляли супернатант. Осадок ресуспендировали в 270 мкл раствора Трис с ЭДТА(0,05 M Трис и 0,02 М ЭДТА), затем добавляли 30 мкл SDS 10 %, тщательноперемешивали и инкубировали 20 минут при 65ºC. После этого смесь охлаждаливо льду 2 минуты. Затем добавляли 75 мкл 5 М ацетата калия и инкубировали вольду 2 часа. Раствор центрифугировали в течение 10 минут на скорости12000 оборотов/мин,жидкуюфракциюпереносиливновыйэппендорф.Добавляли двойной объем 96 % этанола, тщательно перемешивали и сновацентрифугировали 5 минут при температуре 4ºC на скорости 12000 оборотов/мин.Осадок промывали 70 % этанолом, а затем высушивали.

ДНК растворяли в 50 мклводы, нагретой до 65ºC.5.4.3. Оценка митотической стабильности приона [PSI+]Штаммы [PSI+] субклонировали на полной среде, затем отбирали триколонии, которые высевали на среду 1/4 YEPD для детекции прионного фенотипа.Митотическую стабильность рассчитывали как долю колоний с [PSI+] от общегоколичества выросших колоний (Shkundina et al., 2006).495.4.4. Оценка передачи и потери приона [PSI+]Для определения этих параметров использовали разработанную ранееметодику (Afanasieva et al., 2011). Трансформантов, несущих две плазмиды саллелями SUP35, переносили на среды для поддержания только одной из них (приоценке передачи приона селектировали плазмиду с мутантной аллелью, в случаепотери [PSI+] – с геном дикого типа). На этих средах клетки трижды пересевали.Эффективность передачи приона рассчитывали как процент трансформантов Ade+среди трансформантов, потерявших плазмиду с геном дикого типа.

Для оценкипотери приона трех независимых трансформантов ресуспендировали в воде ирассевали на 1/4 YEPD, затем среди клонов, потерявших плазмиду с мутацией,определяли долю Ade-. В обоих случаях наличие плазмид проверяли поспособности клеток расти на среде без соответствующих компонентов.5.4.5. Подсчет количества пропагоновCуспензию клеток высевали на среду с 5 мМ ГГХ. В этих условиях Hsp104pинактивирован (Ferreira et al., 2001), в результате количество пропагоновперестает увеличиваться, а имеющиеся распределяются среди ее потомков (Cox etal., 2003). Через несколько дней роста на среде с ГГХ в отдельных клеткахостаетсянеболееодногопропагона.Образовавшиесяколониизатемсубклонировалии на среде 1/4 YEPD и подсчитывали клоны белого или розовогоцвета. Это число принимали за количество пропагонов, поскольку только клетки схотя бы одним пропагоном могли дать начало колонии [PSI+] (Cox et al., 2003).5.4.6.

Оценка эффективности нонсенс-супрессииШтаммы, несущие плазмиды «WT», «UAA», «UAG», «UGA» (Табл. 3)(использованы авторские названия плазмид) (Wang et al., 2001), культивировали вжидкой селективной среде до оптической плотности при лине волны 600 нм(OD600)0,8-1,2.Из2млкультурыосаждаликлеткиприпомощицентрифугирования в течение 3 минут при ускорении 4000 g. Осадокресуспендировали в 1 мл Z-буфера (60 мM Na2HPO4, 40 мM NaH2PO4 , 10 мM KCl,501 мM MgSO4). К суспензии добавляли 50 мкл хлороформа, интенсивновстряхивали и инкубировали 10 минут при 30 оС. К раствору добавляли 200 мклОНПГ (отро-нитрофенил-β-гактозид) в концентрации 4 мг/мл. Затем смесьинкубировали в темноте при 30оС до момента пожелтения раствора (времяреакции, t(сек), варьировало от 5 минут до 1 часа в зависимости от пробы). Послеэтого к образцам добавляли 500 мкл 1М Na2CO3. Остатки клеток осаждалицентрифугированием при ускорении 10000 g в течение 10 минут.

Затем измерялиоптическую плотность раствора при длине волны 420 нм (OD420). Активностьβ-галактозидазы в пробе вычисляли по формуле (OD 420 х 1000) / (t х OD600).Эффективность нонсенс-супрессии оценивали как соотношение активностиβ-галактозидазы в клетках, несущих конструкцию с нонсенс-мутацией (UAA,UAG, UGA), к активности этого фермента у трансформантов с геном lacZ дикоготипа (WT).

Для каждого штамма проводили по 5 независимых измерений.5.5. Молекулярно-биологические методыВ ходе работы использовали стандартные методы работы с нуклеиновымикислотами: электрофорез ДНК в агарозном геле, рестрикцию, лигирование(Sambrook et al., 1989). Для очистки ПЦР-продуктов, плазмид, выделения ДНК изгеля использовали соответствующие наборы реактивов, согласно методике,рекомендованной производителем («Fermentas»).5.5.1. Сайт-направленный мутагенезДля получения плазмид pRSU1-sup35-M1 и pRSU2-sup35-M1 необходимобыло амплифицировать фрагмент SUP35 с мутацией sup35-M1. Синтез этогофрагмента осуществляли в несколько этапов (Рис.

7). В качестве матрицыиспользовали плазмидную ДНК (pRSU1 или pRSU2 (Volkov et al., 2002)).Праймеры перечислены в таблице 6. Для синтеза ДНК мы использовали смесьполимераз Taq (“Fermentas”) и Pfu (“Fermentas”) в соотношении 9:1. Приподготовке реакционной смеси следовали описанной методике (Sambrook et al.,1989).

Для проведения реакции использовали программу № 1 (Табл. 5).51Рисунок 7. Схема сайт-направленного мутагенеза. На первом этапе происходитамплификация перекрывающихся фрагментов с помощью ПЦР. Один из праймеров,используемых в реакциях на этой стадии, полностью комплементарен матрице, а другойсодержит нуклеотидные замены.

Фрагменты с мутациями, полученные в ходе первого этапа,смешивают. В ходе последующей реакции ДНК-полимераза «достраивает» недостающиеучастки по матрице друг друга.Таблица 5. Программы амплификации ДНК, использованные в работе. * - температура былаподобрана на основе результатов ПЦР с градиентом температур отжига праймеров; ** - 15циклов для получения продукта слияния двух фрагментов, 30 циклов для амплификацииотдельных фрагментов.Номер ДенатурацияДНКАмплификация ДНКДенатурация ДНК Отжиг праймеров * Синтез ДНК15мин, 95оС23ВслучаеКоличество цикловамлификацииЗавершениесинтеза ДНК60 сек, 94оС30 сек, 50оС30 сек, 72оС15/30 **20 мин, 72оС60 сек 94оС30 сек, 55оС30 сек, 68оС1830 мин, 68оС30 сек, 94оС30 сек, 50оС90 сек, 72оС2520 мин, 72оСсайт-направленногомутагенезанаплазмидевекторамлифицировали целиком с помощью праймеров, несущих замены.

Для такойреакции использовали высокопроцессивную и высокоточную ДНК-полимеразуAccuPrime Pfx («Invitrogen»). Праймеры приведены в таблице 6. Матрицейслужила плазмидная ДНК. При подготовке реакционной смеси следовалиописанной методике (Sambrook et al., 1989). Для проведения реакциииспользовали программу № 2 (Табл.

5).52Таблица 6. Праймеры, использованные в работе. В последовательности праймеров выделенынуклеотиды, не комплементарные матрице.НазваниеПоследовательностьИспользованиеMut1_set3_1TATATTGGTACATCTTCTCTTGMut1_set3_4ACCTTCTTGGTAGCATTGСайт-направленный мутагенез спомощью ПЦР. Фланкирующиепраймеры для амплификациифрагмента SUP35.m11_mut_FAGGTGGGTACAAGAAAAATTACm11_mut_RGTAATTTTTCTTGTACCCACCTM1_F2CCAACCTGCAGGTGGGTACAAGAAAAATTACCAAGGTTATTCM1_R2GAATAACCTTGGTAATTTTTCTTGTACCCACCTGCAGGTTGGM2_F2GGGTACCAACAAGGTGGCTATAAAAAGTACAATCCCGACGCCGGM2_R2CCGGCGTCGGGATTGTACTTTTTATAGCCACCTTGTTGGTACCCM3_F2CAATCCCGACGCCGGTTACAAGAAACAGTATAATCCTCAAGGAGGCM3_R2GCCTCCTTGAGGATTATACTGTTTCTTGTAACCGGCGTCGGGATTGM4_F3GTATAATCCTCAAGGAGGCTATAAAAAGTACAATCCTCAAGGCGGM4_R3CCGCCTTGAGGATTGTACTTTTTATAGCCTCCTTGAGGATTATACM5_F4CAATCCTCAAGGCGGTTATAAGAAGCAATTCAATCCACAAGGTGGM5_R4CCACCTTGTGGATTGAATTGCTTCTTATAACCGCCTTGAGGATTGСайт-направленный мутагенез спомощьюПЦР.Праймерысодержат мутацию sup35-M1.Сайт-направленный мутагенез наплазмиде.RNQ1_del_Ka AAATAAAGGTTCTTCTAACAGAGGGTTTGACGTAGGGACTGCGGATCCCCGGGTTAATTAAnMX_FПраймеры для амплификациикассетысKanMX,фланкированнойRNQ1_del_Ka CTGTTGAGAAAAGTTGCCAGAAAAATTGAAGGATTCGTGCT последовательностями,CATCGATGAATTCGAGCTCGnMX_Rкомплементарными гену RNQ1.RNQ1_gene_F TCCTTTGATGCCTGTCTCGTRNQ1_gene_R TTGTTGGTAACCACCGTTGCНабор праймеров для проверкиспецифичности вставки.KanMX_inner_ AGGGTATTCTGGGCCTCCATR5.5.2.

Амплификация ДНК для получения и проверки штаммов сделецией гена RNQ1Для амплификации кассеты с геном KanMX использовали праймеры, которыедополнительно несли на 5'-концах 40 нуклеотидов, комплементарных гену RNQ1.В качестве матрицы использовали плазмидную ДНК pFAG-kanMX4 (Wach et al.,1994).

При подготовке реакционной смеси следовали описанной методике(Sambrook et al., 1989). Для проведения реакции использовали программу № 3(Табл. 5).Для проверки специфичности вставки кассеты сKanMX в геномиспользовали систему из трех праймеров. Набор RNQ1_gene_F и RNQ1_gene_R53(Табл. 6) был подобран для амлификации нативного гена RNQ1, а наличиеПЦР-продукта при использовании праймеров RNQ1_gene_F KanMX_inner_R(Табл.

6) свидетельствовало о вставке кассеты в ген RNQ1. В качестве матрицыдля этих реакций использовали геномную ДНК трансформантов дрожжей,отобранных на среде с канамицином.5.5.3. Денатурирующий электрофорез белков в полиакриламидном геле(SDS-PAGE)В ходе работы для сравнения количества Sup35p в клетках дрожжей, а такжев рамках экспериментов in vitro использовали SDS-PAGE (Laemmli, 1970). Длясравнения состава белков в агрегированной и мономерной фракциях использовалимодифицированный SDS-PAGE с кипячением геля (Kushnirov et al., 2006). Дляполучения лизатов клеток использовали культуры, оптическая плотность которыхпри длине волны 600 нм составляла (OD 600) 0,8-1,2. Лизис клеток проводили нагомогенизаторе FastPrep24 («MP Biomedicals») за счет перетирания стекляннымишариками в лизирующем буфере (30 мM (pH 7,5) Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 10 мМФМСФ (фенилметансульфофторид), коктейль ингибиторов протеаз (Sigma, 20 мклна 1 мл буфера)).

Остатки клеток и шарики осаждали при помощицентрифугирования (10 минут, 800 g, 4оС). Количество тотального белка вполученныхлизатахопределялиметодомБредфорд(Bradford,1976).Концентрацию белка в пробах выравнивали с помощью добавления лизирующегобуфера.После добавления буфера для нанесения в случае стандартного протоколапробы кипятили в течение 5 минут (Laemmli, 1970). Согласно методикеSDS-PAGE с кипячением геля, пробы перед нанесением инкубировали прикомнатной температуре.

Через некоторое время после начала фореза в лункидобавляли буфер для нанесения, а гель целиком инкубировали при 100 оС(Kushnirov et al., 2006).В ходе работы использовали 10 % разделяющий и 5 % концентрирующийполиакриламидные гели (Laemmli, 1970). Белки из геля элюировали на мембранус помощью полусухого переноса (Kyhse-Andersen, 1984).545.5.4. Неспецифическая окраска белковКраситель Кумасси неспецифически окрашивает белки. В нашей работеиспользовалидваметодаокраски:окраскамембраныиокраскаполиакриламидного геля. В первом случае следовали протоколу, описанномуранее (Welinder et al., 2011), с незначительными изменениями. Для этих целейприменяли 0,1 % раствор Кумасси G-250 в смеси метанола и воды 1:1. Времяокраски не более 1 минуты. Для отмывки красителя использовали растворуксусной кислоты, этанола и воды в соотношении 1:5:4, в котором мембрануинкубировали при перемешивании 20 минут, а затем высушивали.Полиакриламидные гели окрашивали 0,25 % раствором Кумасси G-250 всмеси уксусной кислоты, этанола и воды (соотношение 1:4:5) (Sambrook et al.,1989).