Диссертация (Влияние мутаций в прионизующем домене белка sup35 на свойства приона [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae), страница 12

В основеэтого лежит явление нонсенс-супрессии, возникающее в результате включениябелка Sup35 в состав прионных агрегатов (Рис. 1). В случае рассматриваемой61мутацииade1-14преждевременномвштаммахстоп-кодоне[psi-]белковыйисинтезвысвобождаетсяоканчиваетсянаукороченныйнефункциональный фрагмент Ade1p. Биосинтез аденина в таких клетках нарушен,и они не могут расти на среде, не содержащей этой аминокислоты (фенотип Ade -).В присутствии приона эффективность терминации трансляции снижается, чтоприводит к распознаванию мутантного кодона как значащего и синтезуполноразмерного функционального белка Ade1. Благодаря этому дрожжиполучают способность расти на среде без аденина (фенотип Ade+).

На средах1/4 YEPD (Eaglestone et al., 2000) и MD 1/5 Ade (Kaiser et al., 1994) клетки [psi-]после нескольких дней роста приобретают красную окраску вследствиенакопления красного пигмента (амидоимидазолриботид), который являетсясубстратом для фермента Ade1p.

В клетках [PSI+], этого не происходит благодарянонсенс-супресии и синтезу полноразмерного Ade1p.На первом этапе штаммы [PSI+] и [psi-] были трансформированы плазмидамиpRSU1, несущими мутации sup35KK. В качестве контроля использовали аллельPNM2, которая приводит к потере приона даже в присутствии аллели SUP35дикого типа (Doel et al., 1994). Полученных трансформантов проверяли наналичие супрессорного фенотипа, для чего клетки переносили на среду безаденина. Для всех сочетаний мутаций sup35KK с аллелью дикого типа былопротестировано по 8 трансформантов.

Способность расти на среде без аденинапотеряли только клетки, несущие мутации sup35-M2 или PNM2. При этом дляsup35-M2 в половине случаев мы обнаружили сохранение фенотипа приона [PSI+](Рис. 11-12). Производные штамма [psi-], несущие только мутантные аллелиSUP35, имели красный цвет на 1/4 YEPD и не могли расти на среде без аденина(Рис. 13). Этот факт позволил нам установить, что аллели sup35KK не имеютсобственного нонсенс-супрессорного фенотипа.62Рисунок 11. Мутация sup35-M2 приводит к потере прионного фенотипа в присутствииSUP35 дикого типа. Приведены соотношения фенотипов среди трансформантов, несущихаллели sup35KK.

Ade+ - рост на среде без аденина, Ade - - отсутствие роста. Для краткости здесь идалее использованы условные обозначения: WT — аллель SUP35 дикого типа; M1-M5 —мутации sup35-M1 — sup35-M5, соответственно.Рисунок 12. Потеря прионного фенотипа в присутствии PNM2 и sup35-M2. Представленсупрессорный фенотип типичных трансформантов. Клетки высеяны в серии пятикратныхразведений. Градиент концентрации клеток условно изображен в виде стрелки, слеваперечислены сочетания аллелей SUP35.63Рисунок 13. Мутации sup35KK не имеют собственного фенотипического проявления.Представлен супрессорный фенотип штаммов [psi-], несущих различные аллели sup35KK.6.2.2.

При отсутствии аллели SUP35 дикого типа мутации sup35KKоказвают различное влияние на свойства и поддержание приона [PSI+]На следующем этапе на основе трансформантов, представленных нарисунке 11, получили штаммы, которые несли только одну плазмиду (с геномSUP35 дикого типа или его мутантной аллелью). Для этого клетки переносили наполную среду, затем субклонировали. Полученные клоны перепечатывали населективные среды для проверки прототрофности по лейцину и урацилу.

Такимобразом нам удалось отобрать штаммы, потерявшие одну из плазмид. После этогопроверили способность этих штаммов расти на среде без аденина. Для штаммов смутантными аллелями было проанализировано по 16 независимых клонов, саллелью дикого типа — по 8. Мутации PNM2, sup35-M1 и sup35-M2 приводили кполному исчезновению прионного фенотипа (Рис. 14). Поскольку мутацияsup35-M2 приводила к потере прионного фенотипа даже в присутствии аллелидикого типа (Рис. 11), большинство клонов, потерявших плазмиду с sup35-M2 инесущих SUP35 дикого типа, были не способны расти на среде без аденина(Рис.

14). Мутация sup35-M4 усиливала, а sup35-M5 ослабляла фенотип [PSI+](Рис. 15).64Рисунок 14. Аллели PNM2, sup35-M1 и sup35-M2 приводят к потере супрессорногофенотипа. На гистограмме представлены соотношения Ade+ и Ade- фенотипов среди клонов,несущих различные аллели SUP35. Ade+ - рост на среде без аденина, Ade- - отсутствие роста.Отсутствие супрессорного фенотипа клеток могло быть вызвано не толькопотерей приона [PSI+], а, например, его маскированием в присутствии мутантнойаллели SUP35. Для проверки этого предположения мы осуществили обратнуюзаменуплазмид.Дляэтогоштаммысмутантнымиаллелямибылитрансформированы плазмидой pRSU2, несущей ген SUP35 дикого типа.

Наполной среде были отобраны трансформанты, потерявшие вектор с мутацией. Уполученных таким образом штаммов супрессорный фенотип не восстановился(Рис. 15). Это позволило сделать вывод о том, что мутации sup35-M1 и sup35-M2действительно приводят к потере приона [PSI+]. Усиление нонсенс-супрессорногофенотипа [PSI+] в присутствии sup35-M4 сохранилось даже после заменымутациии на аллель дикого типа (Рис. 15). Аналогичные генетическиеманипуляции со штаммом, несущим sup35-M5, привели к полной потереприонного фенотипа (Рис. 15). Таким образом, мы предположили, что две изисследуемых мутаций sup35KK приводят к потере приона, две другие — кизменению варианта [PSI+].65Рисунок 15. Мутации sup35KK приводят к потере или изменению свойств приона [PSI+].Клетки, несущие одну из аллелей, высевали на среду без аденина в серии пятикратныхразведений. Под фотографиями представлена схема эксперимента по замене аллелей SUP35.6.2.3.

Мутации sup35KK не влияют на стабильность белка Sup35pЭффекты мутаций sup35KK, обнаруженные на предыдущих этапах работы,могли быть связаны с изменением стабильности Sup35p. Для проверки этогопредположения мы сравнили количество полноразмерного белка Sup35 вштаммах, несущих мутации sup35KK, с помощью метода SDS-PAGE. Обработкурезультатов вестерн-блот гибридизации осуществляли с помощью программыImageJ. Эксперимент проводился в трех повторностях, полученные результатысравнивали по критерию Вилкоксона (Wilcoxon, 1945). В качестве контролянанесения использовали белок тубулин. Согласно полученным результатам,штаммысразнымимутантнымиаллелямиотносительному количеству белка Sup35p (Рис. 16).sup35KK неотличаютсяпо66Рисунок 16.

Мутации sup35KK не влияют на уровень белка Sup35. На рисунке представленырезультаты SDS-PAGE лизатов клеток, несущих различные мутации sup35KK, с последующейВестерн-блот гибридизацией. [PSI+] и [psi-] - наличие или отсутствие приона в контрольныхштаммах, несущих аллель SUP35 дикого типа.

В качестве контроля нанесения использовалибелок тубулин (Tub1p). Под рисунком приведены средние значения для отношенийSup35p / Tub1p по результатам трех экспериментов, а также соответствующие имсреднеквадратичные отклонения. Для детекции Sup35p использовали поликлональныеантитела к eRF3, для Tub1p — моноклональные антитела к тубулину (Sigma).6.2.4.

Передача и потеря приона в присутствии мутаций sup35KKДля поиска дополнительных отличий в эффектах мутаций sup35KK мыколичественно оценили эффективности передачи и потери приона [PSI+] в ихприсутствии. Для этой цели использовали подходы, предложенные ранее дляизучения межвидового барьера (Afanasieva et al., 2011). Штамм [PSI+]трансформировали векторами с исследуемыми мутациями. Трансформантов,несущих две плазмиды (с геном дикого типа и мутантной аллелью),культивировали на средах для селекции только одной из конструкций.

Черезопределенное время среди клеток, потерявших один из векторов, оценивалипроцент клеток сохранивших нонсенс-супрессорный фенотип (см. раздел«Материалы и Методы»). С помощью этих подходов мы оценили передачу ипотерю приона [PSI+] в присутствии аллелей sup35KK (Рис. 17). Статистическуюобработку результатов осуществляли с помощью точного критерия Фишера(Fisher, 1922).67Рисунок 17. Передача и потеря приона в присутствии мутации sup35KK. * - обозначеныстатистически достоверные отличия (p < 0.05) по сравнению с диким типом.Полученные данные показывают, что к потере приона приводили толькоаллели PNM2 и sup35-M2. Передача приона [PSI+] на мутации PNM2, sup35-M1 иsup35-M2 была снижена или же отсутствовала.

Оба этих факта согласуются сполученными ранее данными. При этом стоит отметить, что эффективностипотери приона для аллелей PNM2 и sup35-M2 достоверно отличались друг отдруга. Это может говорить о том, что исчезновение [PSI+] в присутствии этихмутаций является результатом различных молекулярных механизмов. На данномэтапе мы отказались от дальнейшего исследования аллели PNM2, поскольку ееэффекты и лежащие в их основе механизмы детально описаны.6.2.5. Мутации sup35-M1 и sup35-M2 приводят к исчезновению агрегатовSup35pВходепредыдущихэкспериментовмыдетектировалипотерюнонсенс-супрессорного фенотипа клетками, несущими только мутации sup35-M1и sup35-M2 в отсутствие аллели дикого типа. Чтобы окончательно убедиться висчезновении [PSI+] в этих штаммах, проверили наличие в них агрегатов Sup35p.Для этого использовали две разные методики: SDD-AGE (Kryndushkin et al., 2003;Halfmann et al., 2009) и модифицированным SDS-PAGE для детекции мономернойи агрегированной фракции белков (Kushnirov et al., 2006).

Первый методпозволяет сравнивать размеры крупных белковых агрегатов, поскольку такиекомплексы могут проникать в агарозный гель. Полиакриламидный гель более68плотный, поэтому в него могут входить только мономерные белки. На этойособенности основана модификация SDS-PAGE с кипячением геля (Kushnirov etal., 2006). Согласно предложенной методике, пробы перед нанесением на форезинкубируют при комнатной температуре, в результате в гель могут входить толькомономерные белки, а амилоидные агрегаты остаются на дне лунок. Черезнекоторое время после начала электрофореза в лунки заливают буфер с SDS, игель целиком инкубируют при 100оС.

В этих условиях агрегаты диссоциируют домономеров, которые после подачи тока входят в гель. В результате такогоэксперимента после визуализации можно наблюдать две фракции белка:мономерную и агрегированную. В результате этих двух экспериментов намудалось подтвердить отсутствие агрегатов Sup35p в штаммах с мутантнымиаллелями sup35-M1 и sup35-M2, потерявшими супрессорный фенотип (Рис. 18).