Диссертация (Влияние мутаций в прионизующем домене белка sup35 на свойства приона [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae), страница 14

Мутация sup35-M3 не приводила к заметнымизменениям размеров прионных агрегатов.75Рисунок 25. Изменение размера агрегатов Sup35p в штаммах с sup35-M4 и sup35-M5. Нарисунке представлены результаты SDD-AGE лизатов штаммов [PSI+], несущих различныеаллели SUP35, а также их производных, несущих аллель дикого типа. Белок тироглобулин былиспользован в качестве высокомолекулярного маркера.6.2.11. Все мутантные аллели незначительно увеличивают стабильностьагрегатов Sup35p при нагреванииПо литературным данным, стабильность агрегатов Sup35p при нагреваниисвязана с силой приона, а также может отражать различия в структуре агрегатов(Tanaka et al., 2004; Diaz-Avalos et al., 2005; Alexandrov et al., 2012).

Для оценкиэтого параметра мы использовали модифицированный SDD-AGE. Изменения вметодике затрагивали стадию пробоподготовки, а именно: пробы переднанесением инкубировали в буфере с SDS при различных температурах (от 25 до100оС). При комнатной температуре агрегаты стабильны, но при нагреваниидиссоциируют на отдельные молекулы. Таким образом, в пробах, инкубированныхпри низких температурах, детектируются высокомолекулярные агрегаты Sup35p.При более высоких температурах количество агрегированного белка уменьшается,но ожидаемо увеличивается количество мономеров.

На рисунке 26 представленрезультат одного из таких экспериментов. Последующую обработку изображениймы осуществляли с помощью программы ImageJ 1.47i.76Рисунок 26. Агрегаты мутантных Sup35p отличаются по термостабильности от агрегатовбелка дикого типа. На рисунке представлены результаты SDD-AGE лизатов штаммов [PSI+],несущих различные мутации sup35KK.

Перед нанесением пробы инкубировали при различныхтемпературах в диапазоне от 25оС до 100оС. Для детекции Sup35p использовалиполиклональные антитела к eRF3.Спомощьюописаннойметодикимысравнилиотносительнуютермостабильность агрегатов [PSI+] у штаммов, несущих различные аллелиSUP35. За 100 % мы принимали количество агрегированного Sup35p при 25 оС.Экспериментыпроводиливтрехповторностях.Согласнополученнымрезультатам, все мутации sup35KK приводили к незначительному увеличениюстабильности прионных агрегатов при нагревании по сравнению с SUP35(Рис. 27).Рисунок 27. Мутации sup35KK приводят к изменению термостабильности прионныхагрегатов.

Термостабильность агрегатов Sup35p, сформированных различными мутантнымивариантами этого белка, при нагревании. Перед нанесением на SDD-AGE пробы инкубировалипри различных температурах. Обработку изображений проводили с помощью программыImageJ 1.47i. Во всех случаях для нормализации полученных данных за 100 % принятоколичество агрегированного Sup35p при 25оС. Приведены средние значения, для каждой точкиотложено стандартное отклонение.776.2.12. Мутация sup35-M4 приводит к формированию нового, более«сильного» варианта приона [PSI+]Штаммы [PSI+], несущие только аллели sup35-M4 или sup35-M5, отличаютсяот контрольного варианта по своему нонсенс-супрессорному фенотипу (Рис. 15).Для количественной оценки эффективности прочтения стоп-кодонов в этихштаммах была использована специальная тест-система на основе конструкций сβ-галактозидазой.

В этой системе бактериальный ген lacZ несет преждевременныйстоп-кодон, поэтому синтез функционального фермента возможен толькоблагодаря супрессии нонсенс-мутации. О частоте этих событий можно судить поактивности белка LacZ в дрожжевых клетках. Относительную эффективностьнонсенс-супрессии можно оценивать при сравнении активности β-галактозидазы вклетках с мутантным LacZ по отношению к активности фермента в клетках,несущих конструкцию с геном дикого типа.Рисунок 28. Мутация sup35-M4 приводит к формированию нового варианта приона сболее сильной нонсенс-супрессией. На рисунке приведены результаты оценки относительнойэффективности прочтения стоп-кодонов в штаммах, несущих мутантные аллели SUP35, илипроизводных этих штаммов. Достоверные отличия от штамма [PSI+] с геном дикого типа (либодо, либо после замены плазмид), рассчитанные с помощью теста Вилкоксона, отмечены «*»(* - p < 0,05, ** - p < 0,01). Для подсчета каждого значения использовались минимум пятьповторностей.

WT → WT и M4 → WT — штаммы [PSI+], в которых соответствующую аллельSUP35 (WT или М4) заменили на ген дикого типа.78В нашей работе была использована система плазмид, сконструированная влаборатории Стюарда Пельтца (Wang et al., 2001). Штаммы [PSI+], несущиеразличные мутации sup35KK, трансформировали этими плазмидами. В качествеконтроля использовали штаммы [PSI+] и [psi-] с аллелью SUP35 дикого типа. Длякаждого из штаммов (не менее пяти независимых трансформантов) измерялиактивность β-галактозидазы и рассчитывали относительную эффективностьнонсенс-супрессии.

Статистическую обработку результатов проводили с помощьютеста Вилкоксона. Мы обнаружили значимое увеличение эффективностинонсенс-супрессии кодонов UGA и UAA в штаммах [PSI+] с sup35-M4 посравнению с контрольным вариантом (штамм [PSI+] с SUP35) (Рис. 29). Важноотметить, что эти отличия сохранились и после замены мутации sup35-M4 наSUP35. Штаммы [PSI+] и [psi-] также достоверно отличались друг от друга поэтому параметру. В использованной системе мы не зафиксировали достоверногоснижения частоты прочтения стоп-кодонов в штамме [PSI+] с мутацией sup35-M5(Рис. 29). Полученные результаты подтвердили наше предположение, чтоsup35-M4 приводит к формированию нового, более сильного варианта [PSI+],посколькуувеличениеэффективностинонсенс-супрессиинесвязанонепосредственно с мутацией и сохраняется даже в присутствии аллели дикоготипа.6.2.13.

Мутация sup35-M5 приводит к уменьшению числа пропагонов вклеткеТермин «пропагон» был введен для обозначения дискретных единиц приона,которые передаются в череде поколений (Cox et al., 2003). Количество пропагоновв клетке может варьировать в зависимости от варианта приона (Cox et al., 2003;Tanaka et al., 2006). От этого параметра зависит интенсивность агрегации Sup35pи, как следствие, сила нонсенс-супрессорного фенотипа, поскольку каждыйпропагон является затравкой для этого процесса (Tanaka et al., 2006). Мы сравниликоличество пропагонов в клетках [PSI+], несущих различные мутации sup35KK.

Дляэтого суспензию клеток определенного штамма высевали на среду с 5мМ ГГХ. В79этих условиях блокируется Hsp104p, который разрезает агрегаты Sup35p,увеличивая количество пропагонов. Вследствие этого, количество пропагонов вклетках не увеличивается, а имеющиеся распределяются среди ее потомков(Ferreira et al., 2001; Cox et al., 2003). Колонии, образовавшиеся на среде с ГГХ,рассевали на среде 1/4 YEPD для подсчета количества клонов белого или розовогоцвета, это количество затем принимали за количество пропагонов (Cox et al.,2003). Через несколько дней роста колонии на среде с ГГХ в отдельных клеткахостается не более одного пропагона, и только такие клетки дают начало колониям[PSI+].

С помощью этого подхода мы оценили количество пропагонов в штаммах[PSI+], несущих мутации sup35KK. Для каждого штамма мы анализировали по 10клонов.Полученныеданныеусреднялиисравнивалиспомощьюнепараметрического теста Вилкоксона. В результате удалось обнаружить, чтотолько в клетках с sup35-M5 количество пропагонов достоверно меньше посравнению с штаммом [PSI+], несущим аллель дикого типа (Рис. 29). Этот фактхорошо согласуется с ослаблением нонсенс-супрессорного фенотипа этогоштамма (Рис. 15). В случае остальных мутаций sup35KK мы не зафиксировалиизменений числа пропагонов в клетке, в том числе после замены мутаций нааллель дикого типа.Рисунок 29. Мутация sup35-M5 приводит к уменьшению числа пропагонов в клетке.

Нарисунке представлены усредненные данные по количеству пропагонов в клетке для штаммов,несущих мутациинтную аллель, либо их производных после замены sup35KK на SUP35. Награфиках отложены среднеквадратичные отклонения. Достоверные отличия от штамма [PSI+] сгеном дикого типа (либо до, либо после замены плазмид), рассчитанные с помощью тестаВилкоксона, отмечены «*» (p < 0,05).806.3.

Влияние комбинаций мутаций sup35KK на стабильность приона [PSI+]6.3.1. Мутации sup35-M2 и sup35-M4 дестабилизируют прион [PSI+] присочетании с другими аллелями sup35KKДля изучения эффектов комбинаций аллелей sup35KK использовали штаммы[PSI+], несущие аллели sup35-M3, sup35-M4 и sup35-M5, так как они моглиподдерживать прион. Эти штаммы трансформировали серией плазмид pRSU2,несущих аллели sup35-M1 — sup35-M5. Трансформантов отсевали на селективнуюсреду для поддержания обеих плазмид, после чего оценивали способностьсупрессировать мутацию ade1-14 по характеру роста на селективной среде безаденина.Длякаждойизкомбинацийаллелейбылопроверенопо16 трансформантов (Табл. 7). Мутация sup35-M2 во всех случаях приводила кдестабилизации приона.

Такой же эффект был обнаружен для сочетанийsup35-M4 с sup35-M3, или sup35-M4 с sup35-M5, но только у половинытрансформантов (Табл. 7, Рис. 30). Все остальные комбинации мутаций sup35KK неприводили к дестабилизации приона.Таблица 7. Дестабилизация приона [PSI+] при сочетании sup35-M2 или sup35- M4 с другимимутациями sup35KK.Количество трансформантовс нестабильным [PSI+]Аллель, поддерживающая прион:sup35-M3sup35-M4sup35-M5sup35-M1000sup35-M2161516sup35-M3000sup35-M4908sup35-M5000Вносимая аллель:81Рисунок 30.

Мутации sup35-M2 и sup35-M4 приводят к дестабилизации приона [PSI+].Представлены серии пятикратных разведений типичных трансформантов на средах длядетекции нонсенс-супрессорного фенотипа. Над каждой панелью указана аллель SUP35,поддерживающая прион; слева перечислены аллели, которые были внесены в клетки.6.3.2. Дестабилизация [PSI+] в присутствии сочетаний мутаций sup35KKсопровождается увеличением размера агрегатов Sup35pНа следующем этапе работы мы сравнили размеры агрегатов Sup35p вприсутствии различных сочетаний аллелей sup35KK с помощью методикиSDD-AGE (Kryndushkin et al., 2003; Halfmann et al., 2009).