Диссертация (Функциональная гетерогенность Na,K-АТФазы в скелетной мышце), страница 8

Изоляцию РНКвыполняли с помощью Mini kit (QIAGEN) в роботизированной рабочей станцииQIAcube для автоматической очистки РНК (QIAGEN). ПЦР проводили для оценкиэкспрессии специфических РНК. Реакцию проводили с обратной транскрипциейIII (Invitrogen) и SUPERase (Ambion) для дезактивации РНКазы и ДНКазы.Использовали стандартные комплекты праймерованализовдля1-и2-изоформдля количественных ПЦР-Na,K-АТФазы(AppliedBiosystems).Количественную ПЦР проводили на MX3000P (Agilent Technologies) сиспользованием технологии Taq-Man probe (FAM).

Экспрессия гена быланормирована по отношению к GAPDH и трансферрина (Ct) и представленавеличиной ΔCt. Сравнение экспрессии гена было получено путем вычитанияконтрольного ΔCt (усредненного ΔCt для мышц из контрольной группы) изопытного образца ΔCt (усредненного ΔCt для каждой группы крыс сфункциональной разгрузкой). Относительное изменение экспрессии генов вэкспериментальных группах было стандартизовано по отношению к величинеэкспресии генов в контрольной группе и рассчитывалось по формуле 1/2ΔΔCt.2.7.

Вестерн-блот анализДля определения количества белка 1- и 2-изоформ Na,K-AТФазы в общемгомогенате m. soleus в контрольной и опытной (функциональная разгрузка 6 – 72ч) группах крыс был использован метод Вестерн-блот анализа как описано ранее(Matchkov et al., 2012; Kravtsova et al., 2016). Использовали замороженныемышечные препараты (см. раздел 2.2).41Выделение белка. Ранее изолированные и замороженные (–80ºС) мышцыбез сухожильной части гомогенизировали в буфере для лизиса следующегосостава (в мМ): Трис-HCl –10, сахароза – 250, ЭДТА – 1 и ЭГТА – 1, 2% Triton X– 100, pH 7,4 и ингибитор протеазы (EMD Millipore) из расчета 1 таблетка на 10мл.

Для гомогенизации использовали TissueLyser (QIAGEN). Полученныйгомогенат центрифугировали при 10000 g. Затем собирали образовавшийсясупернатант (над осадочную часть). Процедуры проводили при температуре 40С.После определения концентрации белка в супернатанте с использованиемнабора для анализа – bicinchoninic acid protein (Thermo Fisher Scientific) вычислялиобъем каждой пробы, соответствующий определенному количеству белка.Полученные белковые лизаты растворяли в буфере Леммле следующего состава(в мМ): Dithiothreitol – 6, Tris-HCL – 350, Dithiothreitolnatriumlaurylsulfat 10%,Glycerol 30%, Bromfenolblue 0.123% (Bio-rad, USA) и инкубировали притемпературе 37°С в течение 20 мин.Электрофорез.

Для распределения белков в соответствии с молекулярнымвесом, использовался 10% Трис-глициновый гель (Bio-rad, USA). Объем белковыхпроб, содержащий 10 мкг белка загружался в ячейки геля. Для контролямолекулярного веса использовали маркер Precision Plus ProteinTM Dual ColorStand (Bio-rad, USA). Процедуру электофореза проводили в Трис-глициновомбуфере (Bio-rad, USA) при постоянном напряжении 200 Вт (60 мин; 22ºС).Электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану (GE Healthcare, LifeSciences, USA) проходил под действием электрического тока 100 Вт (60 мин) вбуфере, содержащем 25 mM Tрис, 192 mM глицина, 10% метанола. Мембраныпредварительно инкубировали (5 мин; 22ºС) в 99% этаноле.

Затем мембраны былипроинкубированы 2 ч в 5% обезжиренном сухом молоке, растворенном в ТBS-T(Трис-щелочь, NaCl и 0.5% vol/vol Tween 20 при рН 7.4).Определение белков с помощью специфических антител. Мембраныинкубировали в течение ночи при температуре 4°С с первичными антителами врастворе ТBS-T: козьими антителами против 1-изоформы Na,K-АТФазы (Goatanti sodium pump alpha1 polyclonal antibody), разведенными в пропорции 1:200042(Santa Cruz Biotechnology Inc, USA), кроличьими антителами против 2изоформы (Rabbit anti sodium pump alpha2 polyclonal antibody) 1:2000 (EMDMillipore). В качестве контроля использовали pan-actin 1:1000 (Cell SignalingTechnology).

Затем мембрану отмывали и инкубировали в течение 1 ч совторичными антителами (Dako, Denmark), разведенными в пропорции 1:4000.Связанные антитела проявлялись с помощью усовершенствованного наборахемилюминесценции (ECL; GE Healthcare). Выявленные белки (1- и 2изоформыNa,K-АТФазы)определяликоличественнокакотношениекинтенсивности pan-actin с использованием программного обеспечения ImageJ(National Institutes of Health).2.8.

Пламенная фотометрияИзмерение внутриклеточной концентрации ионов натрия и калия в m. soleusкрысы осуществляли методом пламенной фотометрии (12 мышц) (FLM3,Radiometer, Copenhagen, Denmark), в качестве стандарта использовали литий(Everts, Clausen, 1992). Исследуемые мышцы растягивали до оптимальной длиныи закрепляли на электродах, после чего мышечные препараты выдерживали длядостижения ионного равновесия в течение 60 мин в нормальном растворе КребсаРингера следующего состава (в мМ): NaCl – 25; KCl – 2,5; NaH2PO4 – 1,25; CaCl2– 2; MgCl2 – 1; NaHCO3 – 25, глюкоза – 25.

Раствор аэрировался карбогеном (95%O2 + 5% CO2), температура раствора была 30C. Затем проводили инкубациюпрепаратов в буфере Кребса-Рингера, содержащем 100 нМ никотина. БуферКребса-Рингера был произведен на основе раствора Кребса-Рингера (свышеуказанным составом) и содержал дополнительно (в мМ): Ca2+ – 1.27; K+ – 4;глюкоза – 5. Раствор, содержащий никотин, трижды заменяли на свежий вусловиях темноты. Продолжительность инкубации мышц составила в первойсерии экспериментов 15 мин, во второй 45 мин. После инкубации с никотиномпрепараты инкубировали в течение 10 мин в буфере Кребса-Рингера. После серииинкубаций мышцы быстро переносили в безнатриевый Трис-сахарозный буфер,43охлажденный до 0С.

Отмывание в безнатриевом Трис-сахарозном буферевыполняли 4 раза по 15 мин. После отмывания мышцы взвешивали, маркировали,помещали в мерные контейнеры и экстрагировали в трихлоруксусной кислоте (2мл), затем проводили измерение содержания ионов натрия, калия методомпламенной фотометрии.Экспериментысиспользованиемметодиквестерн-блотанализа,количественной полимеразной цепной реакции (Real-time PCR), пламеннойфотометрии были проведены совместно с д-рами В.В.

Мачковым и Е.В.Бузиновой на базе Department of Biomedicine Aarhus University, Aarhus, Denmark.2.9. Двигательная (функциональная) разгрузка задних конечностейДля изучения механизмов функциональных нарушений Na,K-АТФазы и ееизоформ в условиях иммобилизации скелетной мышцы был применен методантиортостатического вывешивания задних конечностей по Новикову–Ильину вмодификации Morey-Holton, широко используемый в качестве лабораторноймодели гравитационной и двигательной разгрузки (Morey-Holton et al., 2005).

Привоспроизведении данной модели сразу и полностью снимается весовая нагрузкана задние конечности и наблюдается отсутствие электромиограммы в m. soleusкрысы в течение первых суток разгрузки с постепенным восстановлением впоследующий период (Kawano et al., 2004; De-Doncker et al., 2005).Животное находится в положении головой вниз под углом примерно 30град. Фиксирование производится за хвост, который крепится к ползунку нарастяжке вверху клетки, животное может беспрепятственно передвигаетсятолько на передних конечностях, имея свободный доступ к корму и воде. (рис.2.1).44Рис. 2.1. Моделирование двигательной (функциональной) разгрузки заднихконечностей методом антиортостатического вывешивания задних конечностей.2.10.

Хроническое действие никотинаИсследованияхроническогодействияникотинапроводилитремяразличными способами.2.10.1. Локальная доставка никотина к мышцеДля локальной доставки никотина к скелетной мышце нами был использованметод имплантации к мышце силиконового геля, заполненного исследуемымвеществом, что позволяет в течение нескольких суток осуществлятьлокальную аппликацию исследуемого вещества к скелетной мышце (Connoldet al., 1997).

Данный метод ранее применялся для доставки к нервам или мышцамтаких веществ, как нейротоксины, блокаторы ионных каналов, ингибиторыпротеаз. Применительно к никотину этот метод использован нами впервые.В раствор силиконовой резины (3140 RTV, Dow Corning, GmbH) массой 350мг добавляли сухую, механически измельченную соль NaCl в количестве 140 мг,необходимом для получения физиологической концентрации ~0.9%, а такженикотин. Все составляющие смешивались до однородной массы и раскатывалисьна абсолютно гладкой поверхности до состояния 1 мм толщиной. Полученныйраствор высушивали при комнатной температуре в течение 3 суток, после чегохранили при температуре 40С.

Из готового материала вырезали имплантат45(фрагмент размерами ~1х2х5 мм). В ходе операции, проводимой под гексеналовойанестезией, данный имплантат вживляли в задние конечности крысы на 3суток, таким образом, чтобы имплантат контактировал с m. soleus крысы ипри этом располагался во внесинаптическом районе (рис. 2.2). Все процедурыбыливыполненывстерильныхусловиях.Стерилизацияпомещенияосуществлялась с помощью ультрафиолетового облучателя ОБН-05 (Россия).Помещение, в котором содержались прооперированные животные, такжеподвергалось обработке ультрафиолетовыми лучами.

Через 3 суток послевживления имплантата извлекали m. soleus для проведения экспериментов.m. soleusимплантатсинаптический районРис. 2.2. Расположение силиконового имплантата на m. soleus крысы(по: Connold et al., 1997, с изменениями).Мы использовалиразличные модификации геля: гель с низкимсодержанием никотина (0.1 мг никотина на 350 мг силиконового геля) и гель свысоким содержанием никотина (2 мг никотина на 350 мг силиконовогогеля). Условно далее мы будем называть эти модификации ГНСН (гель снизким содержанием никотина) и ГВСН (гель с высоким содержаниемникотина).