Диссертация (Функциональная гетерогенность Na,K-АТФазы в скелетной мышце), страница 6

Есть данные, что фосфолемман, Na,K-АТФаза и Na+/Ca+-обменник ко-29локализованы в поперечных канальцах кардиомиоцитов сердечной мышцы(Geering, 2006; Mohler et al., 2003). В мышечных клетках белок FXYD1 регулируеткинетические свойства Na,K-AТФазы и тормозит каталитическую активностьфермента (Pavlovic et al., 2013; Pirkmajer, Chibalin, 2016). Результатыисследования влияния FXYD1 на активность Na,K-АТФазы противоречивы,возможно, из-за вариабельности уровня фосфорилирования этой изоформыпротеинкиназами А и С, либо вследствие различной ее функциональной роли.***************************Подводя итоги обзора литературы, необходимо отметить, следующее.Современные знания свидетельствуют, что функциональная гетерогенность Na,KАТФазы обусловлена не только её молекулярным разнообразием, но такжеспецифическоймембраннойлокализацией,особенностямирегуляцииивзаимодействием с молекулярным окружением.

Что касается скелетной мышцы,хотя особенности функционирования 1- и 2-изоформ Na,K-АТФазы являютсяпредметом интенсивного изучения, многие вопросы остаются до сих пор невыясненными. К наиболее принципиально важным и нерешенным можно отнестиследующие проблемы. Хотя показана важная роль в поддержании мышечнойработоспособности локализованного в Т-системе пула 2-изоформы Na,KАТФазы, особенности локализации, функционирования и регуляции 2изоформы в других областях сарколеммы не исследованы.

Особый интерес в этомплане представляет область постсинаптической мембраны (концевая пластинка),ответственная за гарантийный фактор нервно-мышечной передачи. Не изученыособенности функционирования, регуляции и взаимодействий с молекулярнымокружением 2-изоформы Na,K-АТФазы в этой области мембраны. Неразработан вопрос возможного влияния КТС на скелетную мускулатуру.Серьезные нарушенияв постуральныхмышцахпригравитационнойидвигательной разгрузке также требуют подобных исследований. В основном этимвопросам посвящена наша работа.30ГЛАВА 2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1. Общая характеристика объектаРаботапроведенанаизолированныхнервно-мышечныхпрепаратахдиафрагмальной и камбаловидной мышц следующих животных:1) самцы белых крыс линии Вистар (Wistar), масса тела 194.7 ± 2.2 (n=147) г;2) самцы мышей C57Bl/6 и mdx, масса тела 25.4 ± 0.4 (n=47) и 30.8 ± 0.4(n=54) г соответственно, возраст 6 месяцев;3) самцы Монгольской песчанки (Meriones unguiculatus), масса тела 54 ± 2 г(n=74).Опытыпроводилинадиафрагмальной(diaphragma,m.phrenicus)икамбаловидной m. soleus (Musculus soleus) мышцах.

Диафрагма – это главнаяинспираторная мышца, являющаяся жизненно важной среди скелетных мышцмлекопитающих. Диафрагма – это смешанная мышца, в её состав входятмышечные волокна 3-х основных типов (быстрые, медленные и смешанные). Этамышца работает постоянно, короткие сокращения чередуются с короткимипериодамиотдыха.Функциидиафрагмыразделяютнадинамическую(дыхательная, кардио-васкулярная и моторно-пищеварительная) и статическую(диафрагмавыполняетработупоподдержаниювнутрибрюшногоивнутригрудного давления) (Ноздрачев и др., 2002; Скопичев и др., 2003).Камбаловидная мышца (m.

soleus) – часть трёхглавой мышцы голени,расположена непосредственно под икроножной мышцей. С верхней сторонымышца крепится к проксимальному отделу большой и малой берцовой кости. Сдругой стороны (нижней) она соединяется с сухожилием икроножной мышцы,образуя ахиллово сухожилие, за которое крепится кпяточному бугру. Этопостуральная мышца, основная функция которой является поддержание позы(Ноздрачев, Поляков, 2001). По волоконному составу мышца относится к группемедленных.31Условия содержания животных и приемы работы с ними соответствовалинормам российского законодательства, а также рекомендациям Guide for the Careand Use of Laboratory Animals http://www.nap.edu/openbook.php?isbn =0309053773.2.2.

Экспериментальная процедура и растворыПосле экстирпации мышцы с культей нерва помещали в чашку Петри,содержащую предварительно аэрированный физиологический раствор. Издиафрагмальной мышцы вырезали полоску правой или левой полудиафрагмышириной около 10 мм; m. soleus использовали в эксперименте целиком. В опытахс микроэлектродной регистрацией и механографией после того, как мышца быларасположена в камере, ее оставляли на 60 мин для уравновешивания в проточномаэрированномфизиологическомрастворе.Использовалифизиологическийраствор для теплокровных животных следующего состава (в мМ): NaCl-137; KCl5; CaCl2-2; MgCl2-2; NaHCO3-24; NaH2PO4-1; глюкоза-11.

Рабочий растворприготовляли из соответствующих маточных растворов. pH раствора составлял7.4-7.5. Раствор непосредственно перед входом в камеру аэрировали карбогеном(95% O2 + 5% CO2). Температура раствора автоматически поддерживаласьпостоянной на уровне +28o С при помощи системы термостабилизации.Некоторые опыты проводили при комнатной температуре.Приток раствора осуществляли с помощью перистальтического насоса MiniStar (World Precision Instruments, Inc., USA), отток из камеры удалялись спомощью вакуумного компрессор-отсоса АИ-6/10 (Эндомедиум плюс, Россия).Часть мышечных препаратов замораживали жидким азотом, с последующимхранением в холодильнике при -80ºС с целью дальнейшего определенияэкспрессии мРНК и количества белка для 1- и 2-изоформ Na,K-AТФазы.322.3.

Микроэлектродная регистрацияВ опытах с микроэлектродной регистрацией мышцу растягивали и спомощью иголок закрепляли на подложке из силгарда в плексигласовой камере,объем которой составлял примерно 2.5 мл. Регистрацию мембранного потенциалапокоя (МПП), потенциала действия (ПД) и входного сопротивления мембраны(Rвх) мышечных волокон проводили с помощью стеклянных микроэлектродов свнутреннимикапиллярами(BF150-110-10)(SutterInstrument,Co.,USA),вытянутых на микрокузнице Sutter P-97 (Sutter Instrument, Co., USA) как описаноранее (Krivoi et al., 2006).

Микроэлектроды заполняли 3 М раствором КCl, ихсопротивление составляло 5 – 7 мОм, собственный потенциал кончика непревышал нескольких мВ.Применяли усилитель с полосой пропускания 0 – 10 000 Гц с входнымсопротивлением предусилителя 1 гОм. Микроэлектрод соединяли с входомпредусилителя через агар-агаровый переходник с помощью хлорированнойсеребряной проволоки.

Индифферентный хлорсеребряный электрод ввинчивали взаполненное агар-агаром "гнездо" в боковой стенке экспериментальной камеры,перемещение которой осуществляли препаратоводителем СТ-12. Подведение кмышечному волокну и погружение микроэлектрода в волокно производили подконтролем бинокулярного микроскопа PZMTIII (WPI). Регистрацию МППпроизводили во внесинаптическом и в постсинаптическом районах мышечныхволокон. Величину МПП производили во внесинаптическом районе мышечныхволокон на расстоянии около 2 мм от мест нервных разветвлений. Это расстояниенамного превышает постоянную пространства, составляющую для мышечныхволокон диафрагмы крысы около 0.6 мм (Zolovick et al., 1970).

Регистрацию МППв постсинаптическом районе осуществляли в месте разветвления нерва. Чтобыубедиться в правильности выбранного района, регистрировали миниатюрныепотенциалы концевой пластинки и анализировали их амплитудно-временныехарактеристики.33Процедура регистрации МПП в индивидуальном мышечном волокне быласледующей. Сразу после погружения микроэлектрода в мышечное волокно нажатием кнопки формировался синхроимпульс, который запускал аналогоцифровой преобразователь ЭВМ и регистрацию МПП.

В опытах с регистрациейПД данный синхроимпульс также формировал стимул длительностью 0.1 мс(Isostim A320; WPI). Этими стимулами (величиной 2 – 3 порога) черезвсасывающий электрод раздражали нерв. После регистрации МПП (ПД)микроэлектрод выводили из данного мышечного волокна, и процедураповторялась с другими волокнами. В каждом волокне регистрировали один ПД,предшествовавший сокращению. Перед количественной обработкой данныхпроизводилсявизуальныйконтрольформыПД,записанныхвпамятикомпьютера.

Такой контроль показал, что в большинстве волокон не искаженныеПД генерировались (и регистрировались) до начала сокращения. ПД, заднийфронт которых был искажен из-за более раннего начала сокращения соседнихволокон, выбраковывались.Значение нуля системы оценивалось при компьютерном усреднении шума(микроэлектрод находился в растворе); смещение нуля корректировали спомощью компьютера перед измерением МПП в каждом волокне.В опытах с измерением Rвх мышечных волокон применяли метод измерениясопротивления микроэлектрода с использованием цепи компенсации входнойемкости предусилителя как описано (Kravtsova et al., 2015а). После погружениямикроэлектродаувеличиваетсявнаволокнообщеевеличинуRвх.сопротивлениеСначала,навходерегистрировалиусилителясобственноесопротивление электрода в растворе, затем после введения микроэлектрода вволокно, регистрировали общее сопротивление микроэлектрода и Rвх мышечноговолокна.

Значение Rвх вычисляли как разницу между измеренными значениямисопротивлений. Таким образом, с помощью такого подхода мы оцениваливеличину Rвх волокон, применяя лишь один микроэлектрод. Такой подход, вотличие от традиционного двух-микроэлектродного метода, не позволяет точнорегистрировать величину сопротивления мембраны, а лишь оценивать общую34величину Rвх (включающую, в том числе, и сопротивление миоплазмы волокна).Вместе с тем, такой метод позволяет без дополнительного повреждениямышечного волокна из-за введения второго микроэлектрода проводить экспрессоценку изменений Rвх при тех или иных воздействиях.В каждом нервно-мышечном препарате на данном временном отрезкеэксперимента регистрировали по: 20 – 35 значений МПП в разных волокнах, 20 –25 значений ПД (и соответствующих для них значений МПП), 25 – 30 значенийRвх в разных волокнах.Дляопределенияиспользовалиэлектрогеннойразработанныйнамиактивностиизоформфизиологическийтест.Na,K-АТФазыПроточныйфизиологический раствор последовательно заменяли на раствор, содержащийуабаин в концентрациях 1 мкМ и затем 500 мкМ, которые блокируют уабаинчувствительную2-иуабаин-резистентную1-изоформыNa,K-АТФазысоответственно (Krivoi et al., 2003).