Автореферат (Молекулярно–генетические и клеточные механизмы дифференцировки симбиотического клубенька)

На правах рукописиЦЫГАНОВВиктор ЕвгеньевичМОЛЕКУЛЯРНО–ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫДИФФЕРЕНЦИРОВКИ СИМБИОТИЧЕСКОГО КЛУБЕНЬКА03.01.05 Физиология и биохимия растений03.02.07 ГенетикаАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степенидоктора биологических наукСанкт–Петербург20182Работа выполнена в лаборатории молекулярной и клеточной биологииФедеральногогосударственногобюджетногонаучногоучреждения«Всероссийский научно–исследовательский институт сельскохозяйственноймикробиологии», г. Санкт–ПетербургНаучный консультант: доктор биологических наук, профессор, академик РАНТихонович Игорь АнатольевичОфициальные оппоненты:КолчановНиколайАлександрович,докторбиологических наук, академик РАН, научный руководитель Федеральногоисследовательского центра Института цитологии и генетики Сибирскогоотделения Российской академии наукЩёголев Сергей Юрьевич, доктор химических наук,профессор, директор Федерального государственного бюджетного учреждениянауки Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмовРоссийской академии наук, зав.

лабораторией иммунохимииГоголев Юрий Викторович, доктор биологических наук,профессор, заведующий лабораторией молекулярной биологии Федеральногогосударственного бюджетного учреждения науки Казанского института биохимиии биофизики Казанского научного центра Российской академии наукВедущая организация: Федеральное государственное бюджетное научноеучреждение «Федеральный исследовательский центр Всероссийский институтгенетических ресурсов растений им. Н.И.

Вавилова»Защита состоится «»______________2018 г. в «» ч на заседании советаД999.167.02 по защите кандидатских и докторских диссертаций при СанктПетербургском государственном университете по адресу: 199034 Санкт–Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, Биологический факультет, ауд. №С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. М. ГорькогоСанкт–Петербургскогогосударственногоуниверситетаинасайтеhttp://disser.spbu.ru/Факс для отзывов: +7 (812) 470–43–62Автореферат разослан «Ученый секретарьДиссертационного совета»________________2018 г.Шарова Елена Игоревна3ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность и степень разработанности темы исследованияВ последние годы во всем мире активно развивается «адаптивное»,«устойчивое» сельское хозяйство (от англ.

sustainable agriculture), направленное напроизводствополноценной,экологическичистойиоздоровляющейсельскохозяйственной продукции (Lal, 2008; Conway, Barbier, 2013).Разрабатываемые агротехнологии в области земледелия должны минимизироватьэкологические риски, способствовать поддержанию, или даже повышениюплодородия почв, обеспечивать создание новых видов сельскохозяйственнойпродукции. Для выполнения этих условий необходимо развивать новые подходы киспользованию генетических ресурсов не только растений, но и микроорганизмов.Привлечение микроорганизмов позволит значительно повысить разнообразиеиспользуемых генетических ресурсов и будет способствовать развитиюадаптивного земледелия (Tikhonovich, Provorov, 2011).

В результатемногочисленных исследований становится ясно, что в ходе эволюции растенияиспользовали определенные функциональные возможности микроорганизмов длярасширения своего адаптивного потенциала. Для этого в геноме растенийпоявлялись генетические факторы, обеспечивающие создание новыхэкологических ниш для микроорганизмов, при этом гены, обеспечивающиепроявление самой адаптации, оставались в геноме микроорганизмов. Одним изярких примеров расширения растениями своего адаптивного потенциала за счетмикроорганизмов является формирование на корнях бобовых растенийсимбиотических азотфиксирующих клубеньков.

При этом многочисленные геныбобовых растений вовлечены в построение собственно клубенька (Борисов et al.,2011), в то же время как за сам процесс азотфиксации ответственны геныпочвенных протеобактерий — ризобий (Cooper, 2007). Таким образом, очевидно,что использование растительно–микробных систем, в основе которых лежитазотфиксирующий симбиоз между бобовыми растениями и ризобиями,представляет чрезвычайно большой интерес для развития адаптивногоземледелия(Tikhonovich, Provorov, 2011; Das, Ghosh, 2012; de Vries, Bardgett, 2012;Rubiales, Mikic, 2015).Развитие клубенька сопровождается различными изменениями в базовыхпроцессах, происходящих в клетке. Факультативность формирования клубеньковделает их уникальной моделью для изучения различных вопросовфункционирования эукариотической клетки, поскольку становится возможнымизучать проявления мутаций, нарушающих развитие клубенька, что невозможнопри изучении других, жизненно важных органов растения.В результате изучения генетической изменчивости по симбиотическимпризнакам были созданы обширные генетические коллекции для различных видовсемейства Бобовых (Bhatia et al., 2001).

Одна из самых представительныхколлекций мутантов по симбиотическим признакам была создана для гороха(Borisov et al., 2000). Тем не менее, проблемы, характерные для традиционныхбобовых культур, связанные с большими физическими размерами геномов итрудностями при разработке эффективных протоколов трансформации, привели ктому, что последовательности данных генов долгое время оставались неидентифицированными.

Использование модельных растений: Lotus japonicus4(Regel) K. Larsen и Medicago truncatula Gaertn. (Stougaard, 2001) открыло путь кидентификации симбиотических генов важных для сельского хозяйства растений сиспользованием геномной синтении и микросинтении (Oldroyd, Downie, 2004;Kouchi et al., 2010; Борисов et al., 2011).Азотфиксирующий клубенек служит уникальной экологической нишей дляризобий,вкоторойподдерживаютсямикроаэробныеусловиядляфункционирования основного фермента азотфиксации — нитрогеназы, котораякрайне чувствительна к кислороду (Oldroyd, 2013). Для размещения ризобий всимбиотическомклубенькедифференцируютсяспециализированныеинфицированные клетки, которые проходят несколько раундов эндоредупликации,увеличиваясь при этом в размерах, и становятся способными дать приют тысячамбактерий. При этом необходимо отметить, что ризобии остаются изолированнымиот цитоплазмы растительной клетки мембраной растительного происхождения свключением бактериальных белков — симбиосомной мембраной (Brewin, 2004).Ризобии также дифференцируются в специализированную для азотфиксацииформу — бактероиды, которые вместе с окружающей их симбиосомноймембраной, формируют симбиосомы (Tsyganova et al., 2018).

Таким образом,инфицированная клетка симбиотического клубенька представляет собойуникальную для бобовых растений систему, появившуюся в ходе эволюции дляобеспечения адаптации растений к нехватке азота в почве и обеспечивающую ихсимбиотрофное питание. В то же время следует заметить, что механизмыдифференцировки клеток симбиотического клубенька, обеспечивающиеспособность растительной клетки к ее заполнению многочисленнымисимбиосомами, а в последствие их функционирование остаются недостаточноизученными.

Коллекция мутантов по симбиотическим признакам являетсяудобным инструментом для исследования молекулярно–генетических и клеточныхмеханизмов дифференцировки клеток симбиотического клубенька, т.к. позволяетиспользовать адекватные генетические модели.В связи с постоянным увеличением антропогенной нагрузки,сельскохозяйственные растения подвергаются действию различных стрессовыхфакторов. К наиболее существенным факторам, влияющим на развитиесельскохозяйственныхрастений,следуетотнеститяжелыеметаллы,радиоактивное заражение, засуху, засоление и уплотненные почвы,формирующиеся в результате использования тяжелой сельскохозяйственнойтехники.Цели и задачи исследованияЦелью данной работы являлось выявление молекулярно–генетических иклеточных механизмов дифференцировки симбиотического клубенька в норме ипод воздействием абиотических стрессорных факторов.Для достижения поставленной цели были сформулированы следующиезадачи:1.

Расширить коллекцию симбиотических мутантов гороха — получитьновые генетические модели — для изучения симбиогенеза. Для этого получить спомощью экспериментального мутагенеза лабораторной линии гороха SGE новые5симбиотические мутанты с нарушениями развития клубеньков и провести ихгенетический анализ.2. Выявить основные симбиотические локусы гороха, контролирующиеранние стадии реализации генетической программы симбиогенеза.3. Разработать принципы перехода от модельных систем к хозяйственнозначимым на примере идентификации гена гороха, ортологичного гену лядвенцаLjNIN, являющегося первым клонированным геном бобовых растений и ключевымрегулятором симбиогенеза на ранних стадиях.4. Изучить роль арабиногалактанпротеин–экстензинов и пероксида водородав реализации генетической подпрограммы инфекции тканей клубенька ризобиямиу гороха.5.

Изучить роль реорганизации тубулинового цитоскелета вдифференцировке клеток симбиотических клубеньков гороха и M. truncatula приреализации поздних этапов генетической программы симбиогенеза.6. Изучить роль этилена в реализации ранних и поздних этапов генетическойпрограммы симбиогенеза у гороха.7. Изучить роль нитратов в реализации генетической программысимбиогенеза у гороха и L.

japonicus.8. Изучить изменения в характере экспрессии генов Rhizobiumleguminosarum bv. viciae при реализации генетической подпрограммы инфекциитканей клубенька ризобиями у гороха.9. Изучить проявления защитных реакций со стороны растения приреализации поздних этапов генетической программы симбиогенеза.10. Изучить финальную стадию дифференцировки клубеньков — старение,завершающую реализацию генетической программы симбиогенеза.11. Получить генетическую модель и исследовать влияние кадмия наразвитие корневой системы и симбиотических клубеньков у гороха.

Изучитьвозможности создания и использования растительно–микробной системы дляфиторемедиации почв, загрязненных кадмием.12. Получить генетическую модель и исследовать влияние плотных почв наразвитие корневой системы и симбиотических клубеньков у гороха.Научная новизнаЗначительно расширена коллекция симбиотических мутантов гороха —получены новые генетические модели — для изучения симбиогенеза. Выявленыновые серии аллельных мутантов для ряда групп комплементации симбиотическихгенов гороха и описан новый локус — Pssym42. Впервые симбиотические локусыPsym33, Psym35 и Pssym38 картированы на генетической карте гороха. Впервые сиспользованием детальной характеристики фенотипических проявлений мутацийи анализа геномной синтении клонирован симбиотический ген гороха Pssym35,что явилось пионерским исследованием в идентификации симбиотических генов ухозяйственно ценных бобовых растений с использованием достижений в генетикемодельных бобовых.