Автореферат (Молекулярно–генетические и клеточные механизмы дифференцировки симбиотического клубенька), страница 6

Изучение изменений в характере экспрессии генов Rhizobiumleguminosarum bv. viciae при реализации генетической подпрограммыинфекции тканей клубенька ризобиями у горохаПроведенный анализ уровней экспрессии поздних бактериальныхсимбиотических генов fnrN, nifA и fixN R. leguminosarum bv. viciae в клубенькахгороха дикого типа и мутантов, блокированных на поздних стадиях развитиясимбиоза, показал, что экспрессия данных генов отсутствует в инфекционныхнитях и зоне инфекции (Рисунок 12).

Ранее для S. meliloti было показано, что дляиндукции генов fixK, nifA и fixN важным условием является снижениепарциального давления кислорода, и экспрессия этих генов в клубеньках M. sativaнаблюдается только в зоне азотфиксации (Soupène et al., 1995). Нами показано, чтонаряду с низким парциальным давлением кислорода, выход бактерий вцитоплазму растительной клетки являются необходимым условием для индукцииэкспрессии генов fnrN, nifA и fixN R. leguminosarum bv.

viciae. Это указывает на25важную роль гена гороха P. sativum PsSym33, контролирующего выход бактерий вцитоплазму растительной клетки.Ранее было показано, что в клубеньках мутантной линии Sprint–2Fix–(Pssym31) наблюдалось постепенное снижение парциального давления кислорода,в отличие от его резкого снижения в дистальной части зоны азотфиксации вклубеньках дикого типа (Romanov et al., 1995). Данный факт может объяснитьнаблюдаемый в ходе данного исследования градиент экспрессии генов fnrN, nifA иfixN R. leguminosarum bv. viciae, и максимум экспрессии этих генов в основанииклубенька (Рисунок 12Е), вероятно, соответствующий максимуму сниженияпарциального давления.Паттерны экспрессии генов nodA и dctA в клубеньках генотипов дикого типаSprint–2, SGE, Sparkle и Finale также был сходен с паттерном, характерным дляконститутивных генов: экспрессия всех слияний наблюдалась в зонах инфекции иазотфиксации.

Экспрессия слияния nodA–lacZ в растительных клетках сдифференцированными бактероидами (в зоне азотфиксации) и клетках сбактероидами, близкими к стадии деградации (в зоне старения) оказалась для наснепредвиденной. Предыдущие исследования описывали репрессию ризобиальныхnod генов сразу после выхода бактерий в цитоплазму растительной клетки(Sharma, Signer, 1990; Schlaman et al., 1991; Schlaman et al., 1992). Таким образом,мы могли ожидать резкое падение в интенсивности окрашивания от серединызоны инфекции к зоне азотфиксации в клубеньках дикого типа.

Тиммерс ссоавторами (1998) показали, что Nod факторы продуцируются в бактериях винфекционных нитях и цитоплазме инфицированных клеток в зоне инфекции итакже все еще детектируются, хотя и на сниженном уровне в бактероидах в зонеазотфиксации. Эти факты указывают на неизвестные функции Nod факторов напоздних стадиях развития клубенька.Количественный анализ показал, что снижение экспрессии генов«домашнего хозяйства» и симбиотических генов (за исключением симбиотическихгенов, регулируемых кислородом) находится в обратной корреляции со степеньюдифференцировки бактероидов, что указывает на общее снижение экспрессиигенов в азотфиксирующих бактероидах.

Также было показано, чтодифференцировка бактероидов является постепенным процессом и способность квозращению к свободноживущему состоянию теряется на финальных стадияхдифференцировки.26Рисунок 12. — Экспрессия конститутивно экспрессирующегося слияния генаTn5–gusA (А, В,Д, Ж, И) и репортерного слияния fixN–gusA (Б, Г, Е, З, К, Л) вклубеньках Fix– мутантов гороха(A, Б) SGEFix––2 (Pssym33), (В, Г) SGEFix––1 (Pssym40), (Д, Е) Sprint–2Fix–(Pssym31), (Ж, З) E135f (Pssym13), (И, К) SGE (дикий тип).

I — зона меристемы; II— зона инфекции; III — зона азотфиксации, III’ — зона в мутантном клубеньке,соответствующая зоне азотфиксации у дикого типа, стрелки указывают наинфекционные нити. Масштабная линейка = 0,4 мм.273.13. Изучение проявления защитных реакций со стороны растения приреализации поздних этапов генетической программы симбиогенезаВ данном исследовании интенсивное окрашивание стенки инфекционнойнити антителом JIM5, которое метит низко метилированные пектины,наблюдалось для одиночных и двойных мутантов, несущих мутацию в генеPssym33.

Для мутанта RisFixV (Pssym42) мечение JIM5 в стенке инфекционнойнити было неравномерным, с образованием кластеров с интенсивнымокрашиванием. Другой отличительной особенностью RisFixV (Pssym42) былоприсутствие метки JIM5 вокруг деградирующих бактероидов, что указывает на то,что низко метилированный пектин инкапсулирует неэффективные бактероиды.Модификации пектина, вызываемые активностью пектин–метилэстераз,существенно изменяют физические свойства низко метилированных форм,вызывая усиление жесткости клеточной стенки и сопутствующее формированиегелеобразных структур для поддержки поврежденной клеточной стенки (Pelloux etal., 2007; Wolf, Greiner, 2012; Bethke et al., 2014).Высокий уровень суберинизации, наблюдаемый в клубеньках мутантнойлинии SGEFix––2 (Pssym33) (Рисунок 13) является примером защитного ответа,который предотвращает проникновение бактерий в цитоплазму растительнойклетки и последующую дифференцировку в бактероиды.

Эти защитные ответыуказывают на то, что мутация в гене Pssym33 ведет к восприятию клубеньковыхбактерий не как микросимбионтов, а как патогенов. Арест в развитии клубенька вовремя дифференцировки бактероидов у мутантной линии SGEFix––1 (Pssym40)также вызывает ошибочное восприятие микросимбионта как потенциальногопатогена. В результате клубенек оказывается изолированным от остальной частирастения посредством суберинизации клубеньковой эндодермы и эндодермы,окружающей сосудистый пучок. Ранее сходный фенотип был описан для мутантаM.

truncatula Mtsym6 (Tirichine et al., 2000) и растений с подавленной экспрессиейв результате РНК–интерференции гена MtHAP2–1 (Combier et al., 2006).Отложение каллозы было связано с инфекцией ризобиями у мутанта по генуPssym42 (Рисунок 14), но не по гену Pssym33. Ранее отложения каллозы былиописаны во время формирования псевдоклубеньков мутантами S. meliloti, снарушенным синтезом экзополисахаридов (Niehaus et al., 1993). В такихпсевдоклубеньках отложения каллозы наблюдались в стенках клеток коры.Отложения каллозы также наблюдались в клубеньках гороха, образованнымимутантами ризобий с нарушенным синтезом липополисахаридов (Perotto et al.,1994). Тем не менее, ранее не были описаны мутанты бобовых растений сдефектами по симбиозу, демонстрирующие усиленное отложение каллозы.28Рисунок 13.

— Гистохимическая локализация отложений суберина в 21–дневных клубеньках мутантной линии SGEFix––2 (Pssym33)(Б, Г) срезы окрашены нейтральным красным. I — меристема, наконечникистрелок указывают на инфекционные нити, стрелки на суберинизированныестенки инфекционных нитей. Клеточные стенки также суберинизированы. (А, В)ДИК, (Б, Г) флуоресцентная микроскопия. (А, Б) сагиттальные срезы. Масштабнаялинейка (А, Б) = 200 мкм, (В, Г) = 20 мкм.Рисунок 14. — Гистохимическая локализация отложений каллозы вклубеньках мутантной линии RisFixV (Pssym42)Срезы окрашены анилиновым синим. ик — инфицированная клетка.Стрелки указывают на отложения каллозы вокруг стенок инфекционных нитей,наконечники стрелок — в клеточных стенках.

(А) ДИК (дифференциально–интерференционный контраст), (Б) флуоресцентная микроскопия. Масштабнаялинейка = 20 мкм.3.14. Изучение финальной стадии дифференцировки клубеньков — старения,завершающей реализацию генетической программы симбиогенезаСтарение является финальным этапом в развитии клубенька. В данномисследовании нами было проанализировано развитие старения у линии дикоготипа SGE и серии неэффективных мутантов, блокированных на различных стадияхразвития клубеньков.В 2–х недельных клубеньках мутанта SGEFix−–7 (Pssym27) в зоне старения убактероидов наблюдались признаки деградации внутри симбиосом, при этом былизначительно увеличены перибактероидные пространства (Рисунок 15А, Б).Наблюдались разрывы тонопласта и присутствие деградированных бактероидов в29вакуоле (Рисунок 15 А, Б), инфицированные клетки содержали амилопласты(Рисунок 15А).

В 2–х недельных клубеньках SGEFix−–3 (Pssym26) в зоне старениябактероиды внутри симбиосом подвергались деградации, в результате чего быливидны остатки бактероидных и симбиосомных мембран (Рисунок 15Б, Г).Рисунок 15. — Ультраструктурная организация клубенька у мутантовSGEFix––3 (Pssym26) и SGEFix––7 (Pssym27)(А, Б) SGEFix––7 (Pssym27). (В, Г) SGEFix––3 (Pssym26).

(А, В)деградирующая инфицированная клетка в зоне старения. (Б, Г) деградирующийбактероид в деградирующей инфицированной клетке в зоне старения. дик —деградирующая инфицированная клетка, дба — деградирующий бактероид, пбп —перибактероидное пространство, в — вакуоль. Масштабная линейка (А, В) = 2мкм; (Б, Г) = 500 нм.Мы провели сравнение транскрипционных паттернов 7 ассоциированных состарением генов у мутантов и линии дикого типа SGE. Эти гены кодируютцистеиновые протеазы 1 (PsCyp1) и 15a (PsCyp15a), тиоловую протеазу (PsTPP),транскрипционный фактор bZIP (PsATB2), альдегид оксидазу 3 (PsAO3), АЦКсинтазу 2 (PsACS2) и АЦК оксидазу 1 (PsACO1).

Гены, кодирующие цистеиновыепротеазы, являются наиболее активно экспрессирующимися генами во времястарения клубенька (Kardailsky, Brewin, 1996; Van De Velde et al., 2006). Старениеклубенька также сопровождается увеличением уровня транскриптов MtATB2(D’haeseleer et al., 2010). Фитогормоны абсцизовая кислота (González et al., 2001) иэтилен (Guinel, 2015) играют позитивную роль в старении клубенька. Вклубеньках линии дикого типа SGE, уровни транскриптов 7 генов,ассоциированных со старением, значительно увеличивались только к 6–й неделе30после инокуляции (НПИ). У мутантов по генам Pssym26, Pssym27 и Pssym40, чьиклубеньки проявляют признаки раннего старения, уровни транскриптовмаркерных генов старения увеличивались уже к 4–й НПИ.