Автореферат (Молекулярно–генетические и клеточные механизмы дифференцировки симбиотического клубенька), страница 3

Исследования проводились с использованием 3–хвидов бобовых растений: важного для сельскохозяйственного производства горохапосевного (Pisum sativum L.) и модельных видов лядвенца японского (Lotusjaponicus (Regel) K. Larsen) и люцерны слабоусеченной (Medicago truncatulaGaertn.).Для проведения исследований с использованием гороха была использованасерия генотипов дикого типа. SGE (Kosterin, Rozov, 1993) и Sprint–2 (Бердников etal., 1989) являются лабораторными линиями, а Finale, Frisson, Rondo, Sparkle —коммерческими сортами.

Также в работе были использованы мутанты посимбиотическим признакам, полученные с использованием вышеуказанныхгенотипов (Borisov et al., 2004). Были использованы полученные в ходевыполнения данной работы мутанты гороха: SGEcrt, характеризующийсяповышенной чувствительностью к плотности субстрата (Tsyganov et al., 2000), иSGECdt, характеризующийся повышенной устойчивостью к кадмию иповышенной его аккумуляцией (Tsyganov et al., 2007).В исследования были вовлечены исходная линия L. japonicus Gifu иполученные на ее основе Fix– мутанты по генам: Ljsym10, Ljsym12, Ljsym13,Ljsym43, Ljsym61, Ljsym67 любезно предоставленные Й.

Стоугаардом (J. Stougaard)(Орхуский университет, Дания).Также были использованы линия дикого типа M. truncatula A17 иполученные на ее основе Fix– мутанты dnf–1 (Wang et al., 2010), efd–1 (Vernié et al.,2008), TR3 (ipd3) (Maunoury et al., 2010; Ovchinnikova et al., 2011).Штаммы клубеньковых бактерий.

В исследованиях были использованыразличные штаммы: Rhizobium leguminosarum bv. viciae CIAM1026 (Safronova,Novikova, 1996), VF39 gusAconst (Voroshilova et al., 2001), VF39 nodA–lacZ (Spainket al. 1987), VF39 dctA–lacZ (Ronson et al., 1987), VF39 fnrN–gusA (T. Patschkowski,неопубликованные результаты), VF39 nifA–gusA (Patschkowski et al., 1996) и fixNc–gusA (Schlüter et al., 1997), 3841 (Wang et al., 1982), Sinorhizobium meliloti штамм490, с конститутивным синтезом флуоресцентного белка mCherry (J. Fournier,LIPM, Тулуза, Франция, неопубликованные результаты).Условия выращивания.

Для генетических экспериментов и размножениярастения выращивались в условиях, описанных ранее (Борисов и др., 1994). Для10проведения остальных экспериментов растения выращивались в контролируемыхусловиях в климатических камерах. Растения выращивались в стерильномвермикулите, кварцевом песке или гидропонном растворе в сосудах различногообъема в зависимости от эксперимента. Использовались безазотные питательныерастворы (Fähraeus, 1957; Borisov et al., 1997). Для анализа влияния хлоридакадмия на функционирование симбиотических клубеньков мутанта SGECdt илинии дикого типа SGE растения были выращены в условиях жидкой гидропоннойкультуры (Tsyganov et al., 2007).Методика проведения мутагенеза и отбора мутантов. В качествемутагена был использован этилметансульфонат.

Методика проведения мутагеннойобработки была описана нами ранее (Борисов и др., 1994).Гибридологический анализ. Были использованы классические методыгибридологического анализа. При проведении комплементационного анализа Nod–и Fix– мутантов в качестве тестерных линий были использованы Nod– и Fix–мутантыизколлекцииФБГНУВНИИСХМ(http://www.arriam.spb.ru/rus/lab9/collections.html),представляющиевсеидентифицированные к настоящему времени гены, контролирующие ранние ипоздние стадии развития клубеньков, соответственно.Анализ совместного наследования.

Проводился с использованиемкомпьютерной программы PLANT (С.М. Розов, Институт цитологии и генетикиСО РАН). Построение генетических карт районов локализации локусов интересапроводили с помощью программы AntMap (Iwata, Ninomiya, 2006) или программыJOINMAP (Stam, 1993).В работе были использованы следующие методики, описанные ранее:пробоподготовки и иммунолокализации для световой, лазерной сканирующейконфокальной и электронной микроскопии (Stumpe et al., 2006; Цыганова и др.,2009: Kitaeva et al., 2016); гистохимические и цитохимические методики (Lulai,Morgan, 1992; Currier, Strugger, 1956; Bestwick et al., 1997); анализа развитияинфекции и формирования клубеньков (Tsyganov et al., 2002); анализа экспрессиибактериальных генов (Voroshilova et al., 2001); cветовой микроскопии, лазернойконфокальной сканирующей микроскопии, электронной микроскопии (Ivanova etal., 2015; Kitaeva et al..

2016; Цыганова и др., 2009); выделение растительной ДНКи геномной ДНК бактерий, выделение плазмидной ДНК, рестрикция ДНК спомощью эндонуклеаз, лигирование ДНК (Sambrook et al., 1989); ПЦР с детекциейв реальном времени (Serova et al., 2017); SSAP анализа (Цыганов и др., 2012);лазерной микродиссекции (Serova et al., 2017); количественного анализаэкспрессии транскрипционных репортерных слияний lacZ и gusA (Tsyganov et al.,2003); анализа влияния экзогенных гормонов, определения содержания гормонов(Tsyganov et al., 2000).Методика определения кадмия. Кадмий определяли методом масс–спектрометрии с индуктивно–связанной плазмой (ИСП–МС) на приборе "Agilent7700" фирмы "Agilent Technologies", США.11Глава 3. Результаты и обсуждение3.1. Выделение симбиотических мутантовВ ходе скрининга мутантов по симбиотическим признакам былопроанализировано 425 семей (2069 растений) поколения М2.

Наблюдалисьрастения с различными отклонениями от фенотипа клубеньков исходной линии.Были выявлены 13 потенциальных мутантов, неспособных формироватьклубеньки (фенотип Nod–) и 2 потенциальных мутанта, формирующих единичныеклубеньки (фенотип Nod+/–). Кроме того, были обнаружены 30 потенциальныхмутантов, формирующих неэффективные клубеньки (фенотип Fix–).3.2.

Гибридологический анализВ гибридологический анализ были вовлечены потомки потенциальныхмутантов из семей М2 — мутантные растения поколения М5, показавшиестабильность проявления мутантного фенотипа в ряду 3–х поколений. Прианализе расщепления F2 от скрещивания мутантов с исходной линией былиотобраны сегреганты с проявлением мутантных фенотипов, на основе которыхпосле селекции в ряду пяти поколений были созданы мутантные линии SGENod––9, SGEFix––5 SGEFix––6, SGEFix––7, SGEFix––8 и SGEFix––9.3.3. Комплементационный анализВ комплементационный анализ были включены как ранее полученныемутанты (Tsyganov et al., 1994), так и полученные в ходе данной работы.

Былопоказано, что мутанты SGENod––1 и SGENod––3 несут мутации в гене Pssym35,мутант SGENod––2 — в гене Pssym14, мутант SGENod––6 — в гене Pssym7,мутанты SGENod––4 и SGENod––8 — в гене Pssym38. Также было показано, чтомутантный фенотип линии SGEFix––5 определяется мутацией в гене Pssym33,линии SGEFix––6 — мутацией в гене Pssym40, линии SGEFix––7 — мутацией вгене Pssym27, линии SGEFix––8 — мутацией в гене Pssym25.Комплементационный анализ мутантной линии RisFixV, индуцированной на сортеFinale показал, что она несет мутацию в ранее не идентифицированном локусе,получившем обозначение Pssym42.Мутанты, индуцированные на линии SGE, были отнесены к ранее описаннымгруппам комплементации.

Данный факт свидетельствует, по–видимому, облизости решения задачи — выявления полного круга симбиотических геновгороха, выявляемых методами экспериментального мутагенеза. Таких генов, насегодняшний день, обнаружено чуть более 40 (Борисов и др., 2011).3.4. Локализация симбиотических генов на генетической карте горохаВпервые были локализованы симбиотические локусы: Pssym33 (Рисунок 1),Pssym35 и Pssym38, в I и V группах сцепления гороха, соответственно.12Рисунок 1. — Карта региона d—Pssym33—i.

Расстояния даны в сМТакже было значительно уточнено строение района III группы сцеплениягороха, содержащего симбиотический ген Pssym31 и определено его точноерасположение относительно 8 молекулярных и 3 морфологических маркеров(Рисунок 2).Рисунок 2. — Генетическая карта района локализациисимбиотического локуса Pssym313.5. Выявление основных симбиотических локусов гороха,контролирующих ранние стадии реализации генетической программысимбиогенезаСамый ранний блок инфекционного процесса наблюдался у мутантовRisNod14 (Pssym7) и SGENod––6 (Pssym7) на стадии колонизации инфекционныхкарманов в скрученных корневых волосках (Crh– фенотип).

Мутанты RisNod8(Pssym35), SGENod––1 (Pssym35), SGENod––3 (Pssym35) и SGENod––2 (Pssym14)были блокированы на последующей стадии инфекционного процесса — во время13инициации роста инфекционной нити (Iti– фенотип). Таким образом, у гороха, покрайней мере, два локуса вовлечены в контроль над инициацией ростаинфекционной нити. При этом мутанты по гену Pssym35 характеризовалисьсильно увеличенным числом деформированных и скрученных корневых волосков.Мутант RisNod4 по гену Pssym37 и 3 аллельных мутанта RisFixF, SGENod––4 иSGENod––8 по гену Pssym38 были блокированы на стадии роста инфекционнойнити в корневом волоске.

Сходный фенотип наблюдался для линий гороха,несущих аллель Pssym2A (Geurts et al., 1997) и мутанта DK24 (Pssym36) (Sagan etal., 1994). Таким образом, у гороха, по крайней мере, 4 локуса контролируютразвитие инфекционной нити в корневом волоске от инфекционного кармана к егооснованию.

Два аллельных мутанта RisNod1 (Pssym34) и RisNod23 (Pssym34) былиблокированы на более поздней стадии инфекционного процесса — во время ростаинфекционной нити в клетках коры (Itr– фенотип). Ранее у гороха сходныйфенотип — арест инфекции в клетках коры был описан для мутантов E2 по генуPssym5 (Guinel, Larue, 1991) и мутанта R50 по гену Pssym16 (Guinel, Sloetjes, 2000).Таким образом, у гороха, по крайней мере 3 локуса контролируют развитиеинфекционной нити в клетках коры. Было показано, что аллельные мутантыSGENod––6 и RisNod14 по гену Pssym7, мутант по гену Pssym14 (SGENod––2) итри аллельных мутанта SGENod––1, SGENod––3 и RisNod8 по гену Pssym35лишены каких–либо признаков развития тканей клубенька, включая деления корыкорня (Ccd– фенотип), но характеризовались скручиванием корневых волосков(Hac+ фенотип).