Автореферат (Молекулярно–генетические и клеточные механизмы дифференцировки симбиотического клубенька), страница 7

Высокие уровнитранскриптов генов, ассоциированных со старением, наблюдались в клубенькахмутанта SGEFix−–2 (Pssym33), который не проявляет фенотип раннего старения.С помощью лазерной микродиссекции в клубеньках дикого типа SGE имутанта SGEFix−–7 (Pssym27) были определены транскрипционные паттерны 7–миассоциированных со старением генов. Инфицированные клетки из зоны III быливырезаны из 2–х недельных клубеньков дикого типа SGE (Рисунок 16), из 4–хнедельных клубеньков были вырезаны инфицированные клетки из зоны III и зоныIV.

У мутантной линии SGEFix−–7 (Pssym27) из 2–х недельных клубеньков быливырезаны инфицированные клетки, соответствующие зоне III в клубеньках дикоготипа (зона III′) и из хорошо различимой зоны IV.Рисунок 16. — Лазерная микродиссекция и катапультированиеинфицированных клеток из 2–х недельных клубеньков линии дикого типаSGE(А) Гистологическая организация клубенька. (Б) инфицированные клетки иззоны III перед катапультированием (В), инфицированные клетки из зоны III послекатапультирования, (Г) изолированные клетки. I — меристема, II — зонаинфекции, III — зона азотфиксации; стрелки указывают на вырезанные области.Масштабная линейка (А) = 150 мкм, (В–Г) = 75 мкм.На клеточном уровне мутант SGEFix−–7 (Pssym27) показал увеличеннуютранскрипцию генов, ассоциированных со старением, в зоне, соответствующейзоне азотфиксации в диком типе (Рисунок 17).

Сходное увеличение уровнейтранскриптов генов, ассоциированных со старением, по сравнению с диким типомSparkle, наблюдалось нами ранее у мутанта E135F (Pssym13) (Serova et al., 2017).Тем не менее, транскрипты PsCyp1 не детектировались в клетках клубеньковдикого типа и мутанта SGEFix−–7 (Pssym27). Это подтверждает, что протеазаPsCyp1 не вовлечена в старение центральной части клубенька, а можетучаствовать в старении периферических тканей клубенька.31Рисунок 17. — Относительный уровень транскриптов PsCyp15a, PsTPP,PsATB2, PsAO3, PsACS2 и PsACO1 в инфицированных клетках из зон III (III*)и IV клубеньков гороха линии дикого типа SGE и мутантной линии SGEFix––7 (sym27) через 2 и 4 недели после инокуляцииБуквы (a, b, c) указывают достоверные различия (P≤0,05): a — от 2–хнедельных клубеньков линии дикого типа SGE (зона III); b — между зонами III иIV в 4–х недельных клубеньках линии дикого типа SGE; c — между зонами III* иIV в 2–х недельных клубеньках линии SGEFix––7 (Pssym27).

Разрыв в графикеуказывает изменения в шкале. зона III* — зона, соответствующая зонеазотфиксации в клубеньках дикого типа.323.15. Получение генетической модели для исследования влияниякадмия на развитие симбиотических клубеньков у горохаСпомощьюЭМС–мутагенезабылполученмутантSGECdt,характеризующийся повышенной устойчивостью к кадмию (Рисунок 18), а такжеувеличенным его накоплением в тканях растения. Данная мутация былалокализована в VI группе сцепления гороха (Рисунок 19). Следует отметить, чтодо недавнего времени у высших растений не было описано мутаций,приводящих к повышенной устойчивости к кадмию (Кулаева, Цыганов, 2010).Лишь совсем недавно у Arabidopsis thaliana были выявлены мутанты,характеризующиеся повышенной устойчивостью к кадмию, однакомолекулярная природа данных мутаций еще не выяснена (Watanabe et al., 2010).Было показано, что мутация cdt приводит к повышенной устойчивости к кадмиюпо сравнению с линией дикого типа формирующихся на корнях мутантаклубеньков.

Данный мутант является адекватной генетической моделью дляизучения устойчивости растительно–микробных систем к действию тяжелыхметаллов.Рисунок 18. — Растение мутанта SGECdt (слева) и растения дикоготипа SGE (справа), выращенные в присутствии 3 мкМ CdCl233Рисунок 19. — Генетическая карта района локализации локуса cdt3.16. Получение трансгенных штаммов R. leguminosarum и изучениевозможности создания и использования растительно–микробной системы дляфиторемедиации почв, загрязненных кадмиемБыли получены два трансгенных штамма Rhizobium leguminosarum bv.viceae 3841–PsMT1 и 3841–PsMT2, несущие конструкции nifH–PsMT1 и nifH–PsMT2.

Генетические конструкции представляют собой кодирующие областирастительных генов PsMT1, PsMT2 (кодирующих металлотионеины), слитые спромоторной областью гена nifH клубеньковых бактерий гороха. Былопоказано, что трансгенные штаммы увеличивают содержание кадмия как вкорнях и клубеньках (Рисунок 20), так и в стеблях растений гороха (Рисунок21). Использование для биоремедиации почв, загрязненных тяжелымиметаллами, симбиотических систем, таких, как бобовые растения и ризобии,представляет большой интерес, поскольку наряду с извлечением тяжелыхметаллов такие системы позволяют обогащать почву питательными элементами(прежде всего азотом и фосфором) (Pajuelo et al., 2011; Ahmad et al., 2012;Mandal, Bhattacharyya, 2012).содержание Cd, ppm3410009008007006005004003002001000SGE        SGE       SGE       SGECdt  SGECdt  SGECdt 3841 3841‐3841‐3841 3841‐3841‐PsMT1  PsMT2 PsMT1  PsMT2 содержание Cd, ppmРисунок 20.

— Содержание кадмия в корнях с клубеньками приинокуляции линии гороха дикого типа SGE и мутанта SGECdt исходнымштаммом R. leguminosarum bv. viceae 3841 и трансгенными штаммами3841-PsMT1 и 3841-PsMT2 в условиях отсутствия CdCl2 и при добавлении0,5 мкМ CdCl21614121086420SGE        SGE       SGE       SGECdt  SGECdt  SGECdt 3841 3841‐3841‐3841 3841‐3841‐PsMT1  PsMT2 PsMT1  PsMT2 Рисунок 21.

— Содержание кадмия в стеблях при инокуляции линиигороха дикого типа SGE и мутанта SGECdt исходным штаммомR. leguminosarum bv. viceae 3841 и трансгенными штаммами 3841-PsMT1 и3841-PsMT2 в условиях отсутствия CdCl2 и при добавлении 0,5 мкМ CdCl23.17. Получение генетической модели для исследования влиянияплотных почв на развитие корневой системы и симбиотическихклубеньков у горохаСпомощьюЭМС–мутагенезабылполученмутантSGEcrt,характеризующийся повышенной чувствительностью корневой системы кплотности субстрата.

Мутация была локализована в V группе сцепления гороха.Было показано этилен–зависимое проявление мутантного фенотипа (Рисунок22). Данный мутант являлся адекватной моделью для изучения влиянияплотности субстрата на процесс формирования симбиотических клубеньков с35целью создания растительно–микробных систем с повышенной устойчивостьюк абиотическим стрессовым факторам.Рисунок 22. — Влияние экзогенного этилена на развитие корневыхсистем у линии дикого типа SGE и мутантной линии SGEcrtЗАКЛЮЧЕНИЕПеред современным агропромышленным производством стоятмногочисленные вызовы, одним из которых является необходимостьповышения устойчивости сельскохозяйственного производства к стрессовымфакторам.

Перспективным подходом к решению этой проблемы являетсясоздание растительно–микробных систем, в которых по принципудополнительности геномов происходит формирование функциональноинтегрированных генетических систем с расширенным адаптационнымпотенциалом. Наиболее известная и наиболее эффективная растительно–микробная система создается при реализации генетической программысимбиогенеза бобовых растений. В данной работе нами было предпринято еевсестороннее изучение.Нами была значительно расширена коллекция мутантов гороха посимбиотическим признакам, которая позволила получить новые адекватныегенетические модели и изучить различные аспекты дифференцировкисимбиотическогоклубенька.Всепроанализированныемутанты,индуцированные на линии SGE, были отнесены к ранее описанным группамкомплементации.

Лишь для мутанта RisFixV, индуцированного на сорте Finale,была показана принадлежность к новой группе комплементации — Pssym42.Данный факт свидетельствует, по-видимому, о близости решения задачи —выявления полного круга симбиотических генов гороха, выявляемых методамиэкспериментального мутагенеза.36Детальный анализ развития клубеньков у серии мутантов гороха,блокированных на ранних стадиях развития симбиоза, позволил предположитьсуществование двух генетических подпрограмм развития симбиотическогоклубенька: инфекции тканей симбиотического клубенька и органогенезаклубенька. При этом были выявлены точки взаимного контроля реализацииданных подпрограмм.С использованием анализа геномной синтении между горохом и L.japonicus был клонирован ген Pssym35.

Его клонирование позволило создатьметодологию использования достижений генетики модельных бобовых длявыявления симбиотических генов культур, важных для сельского хозяйства.Входепроведенияанализараспределенияарабиногалактанпротеин-экстензинов в клубеньках гороха была выявленаважность механизма их направленной секреции в просвет инфекционной нитидля ее нормального функционирования. Было показано, что пероксид водородане только принимает участие в защитных реакциях, но и является необходимымкомпонентом при созревании инфекционных нитей в ходе дифференцировкиклубенька.Была выявлена трехмерная структура тубулинового цитоскелета исимбиотических структур в различных типах клеток в клубеньках M. truncatula игороха.

В результате была выявлена ведущая роль эндоплазматическихмикротрубочек в росте и функционировании инфекционных нитей и капель.Кортикальные микротрубочки по мере дифференцировки неинфицированных иколонизированных клеток образуют паттерн, характерный для клеток корня изпереходной зоны: микротрубочки формируют расположенные поперечноотносительно продольной оси клетки пучки. В то же время при выходе бактерийиз инфекционных капель данный паттерн изменяется на неупорядоченный, что,вероятно, является необходимым условием для последующего увеличенияразмеров инфицированной клетки в ходе дифференцировки.

Паттерныэндоплазматических микротрубочек вокруг симбиосом в клубеньках гороха и M.truncatula различались, что отражает разницу в структуре симбиосом.В данном исследовании были получены новые доказательства, что этиленконтролирует развитие клубеньков на различных стадиях: при ростеинфекционной нити в коре корня, а также при формировании клубеньковоймеристемы, что было показано при выявлении нового этилен–чувствительногомутанта по гену Pssym12.

Более того, было выявлено, что этилен, вероятно,контролирует и функционирование меристемы в зрелом клубеньке.Качественный и количественный анализ экспрессии бактериальныхгенов, связанных и не связанных с симбиозом, показал, что их экспрессияпостепенно уменьшается в ходе реализации программы дифференцировкибактероидов, за исключением симбиотических генов, регулируемыхкислородом.В данной работе было продемонстрировано, что единичные мутации вгенах гороха, контролирующие поздние стадии развития симбиоза, приводят киндукции специфических защитных реакций, имеющих различные проявления.37Таким образом, полезные бактерии в ходе неэффективного симбиогенезавоспринимаются как патогены.Нами было показано, что гены, ассоциированные со старением,активируются в клубеньках мутантов, у которых развитие клубеньковблокировано на различных стадиях.