Автореферат (Молекулярно–генетические и клеточные механизмы дифференцировки симбиотического клубенька), страница 2

Впервые показано существование двух генетическихподпрограмм симбиогенеза и выявлены точки их взаимного контроля. Впервыевыявлена трехмерная организация тубулинового цитоскелета в клубеньках горохаи M. truncatula, которая сопоставлена с организацией симбиотических структур в6каждой гистологической зоне клубенька. Впервые показано, что этилен необходимдля развития клубеньковой меристемы и функционирования меристемы в зреломклубеньке. Впервые показано, что выход ризобий в цитоплазму растительнойклетки являются необходимыми условиями для индукции экспрессии генов fnrN,nifA и fixN R.

leguminosarum bv. viciae в процессе формированияазотфиксирующего клубенька гороха. Впервые выявлено отсутствие репрессиисимбиотического гена R. leguminosarum bv. viciae nodA в бактериях после выходаиз инфекционных нитей, что указывает на важную функцию Nod–факторов напоздних стадиях развития клубенька. Впервые показано, что растения горохамогут воспринимать ризобии в качестве патогенов в случае единичных мутаций вгенах, контролирующих поздние стадии развития клубенька.

Впервые показано,что старение клубенька является универсальной реакцией на неэффективностьсимбиоза. Впервые получена мутация высшего растения, приводящая как кповышенной устойчивости к кадмию, так и его увеличенной аккумуляции в тканяхрастения. Впервые показано, что единичная мутация в геноме гороха можетприводить к повышенной устойчивости к кадмию процесса формирования ифункционирования симбиотических клубеньков. Впервые показано, чтокомбинация устойчивого к кадмию мутанта гороха и штаммов ризобий, несущихгены гороха, кодирующих металлотионеины, может быть перспективной дляцелей фиторемедиации почв, загрязненных тяжелыми металлами. Впервыеполучена мутация гороха с повышенной чувствительностью к плотностисубстрата.Теоретическое и практическое значениеПоказано существование двух генетических подпрограмм развитиясимбиотического клубенька: 1) инфекции тканей клубенька ризобиями («судьбы»бактериальной клетки) и 2) органогенеза клубенька.

Разработана методологияиспользования достижений генетики модельных бобовых для клонированиясимбиотических генов у важных для сельского хозяйства бобовых растений.Инициировано новое направление исследований — сравнительная клеточнаябиология бобовых растений. В результате проведения исследований в данномнаправлении выявлены некоторые закономерности формирования временныхклеточных органелл микробного происхождения — симбиосом и их размещения винфицированной клетке.стабилизацииИзученымолекулярно–генетическиемеханизмысимбиогенеза, которые являются теоретическими основами для созданиявысокоэффективных растительно–микробных взаимодействий.

Полученныетрансгенные штаммы 3841–PsMT1 и 3841–PsMT1 являются перспективными дляиспользования в растительно–микробной системе, которая может бытьиспользована при создании технологий «симбиотической инженерии» дляфиторемедиации почв, загрязненных кадмием. Данные штаммы депонированы вВедомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственногоназначения ОСХН РАН.7Защищаемые положения диссертации:1. Множественный генетический контроль симбиогенеза включает двегенетические подпрограммы: органогенез клубенька и инфекцию тканейклубенька ризобиями. При этом выявлены точки взаимного контроляреализации данных подпрограмм: 3 точки для инфекции тканей клубенькаризобиями и 1 для органогенеза клубенька.2. Модельные бобовые растения могут быть использованы для идентификациигенов хозяйственно значимых бобовых культур, что продемонстрированопри клонировании гена гороха PsSym35 на основе синтении с геном L.japonicus LjNIN, первого клонированного гена бобовых растений иключевого регулятора симбиогенеза.3.

Арабиногалактанпротеин–экстензины и пероксид водорода являютсянеобходимыми компонентами при реализации генетической подпрограммыинфекции тканей клубенька ризобиями у гороха.4. Реорганизация тубулинового цитоскелета является одним из основныхмеханизмов дифференцировки клеток симбиотического клубенька приреализации генетической программы симбиогенеза. Выход бактерий изинфекционных капель в цитоплазму растительной клетки инициируетреориентацию кортикальных микротрубочек в клубеньках гороха и M.trincatula, направленную на создание условий для увеличения размераинфицированнойклетки.Эндоплазматическиемикротрубочкисопровождают рост инфекционных нитей и формирование инфекционныхкапель во время развития симбиотических клубеньков гороха и Medicagotruncatula.Различныйхарактерпаттерновэндоплазматическихмикротрубочек вокруг симбиосом в клубеньках гороха и M. truncatulaсвязан с различиями в морфологии бактероидов у этих видов.5.

Этилен участвует в реализации генетической программы симбиогенеза наразличных стадиях: при росте инфекционных нитей в коре корня,формировании клубеньковой меристемы и функционировании меристемы взрелом клубеньке.6. Мутации в симбиотических генах как гороха, так и L. japonicus,нарушающих симбиогенез на поздних стадиях, могут одновременнонарушать нитрат–зависимую регуляцию клубенькообразования.7. Выход ризобий в цитоплазму растительной клетки является необходимымусловием для индукции экспрессии генов fnrN, nifA и fixN R. leguminosarumbv.

viciae при реализации генетической подпрограммы инфекции тканейклубенька ризобиями у гороха. Отсутствие репрессии симбиотического генаR. leguminosarum bv. viciae nodA в бактериях после выхода из инфекционныхнитей указывает на важную функцию Nod–факторов для реализациигенетической программы симбиогенеза на поздних стадиях.8. Дифференцировка бактероидов является постепенным процессом, онасопровождается снижением уровня экспрессии генов в азотфиксирующихбактероидах (за исключением симбиотических генов, регулируемыхкислородом), при этом способность к возращению к свободноживущемусостоянию теряется на финальных стадиях дифференцировки.89.

Растение–хозяин строго контролирует реализацию генетической программысимбиогенеза не только на ранних, но и на поздних стадиях развитиясимбиоза. Мутации в единичных генах гороха могут приводить квосприятию эффективных штаммов ризобий в качестве патогенов.10. Преждевременный запуск завершающей стадии реализации генетическойпрограммы симбиогенеза — старения симбиотического клубенька являетсяуниверсальной реакцией на его неэффективность.

Этилен и абсцизоваякислота являются позитивными регуляторами старения.11. Устойчивость к кадмию как растений гороха, так их симбиотических систем(клубеньков) определяется общими генетическими факторами, в частностигеном Pscdt.12. Трансгенныештаммы3841–PsMT1и3841–PsMT1являютсяперспективными для использования в растительно–микробной системе(кадмий–устойчивый мутант гороха SGECdt — штаммы 3841–PsMT1 и3841–PsMT1), которая может быть использована при создании технологий«симбиотической инженерии» для фиторемедиации почв, загрязненныхкадмием.13.

Тигмоморфогенетические реакции корня у гороха, стимулируемые плотнымсубстратом, опосредуются этиленом и сопровождаются изменениями ворганизации тубулинового цитоскелета. Развитие тигмоморфогенетическихреакций негативно влияет на реализацию генетической программысимбиогенеза.Степень достоверности и апробация результатовВысокая достоверность полученных результатов обеспечена использованиемадекватных генетических моделей, многочисленными повторностями экспериментов,использованием современного высокоточного прецизионного оборудования,проведением статистической обработки полученных результатов. Материалыдиссертации были представлены на 60–ти отечественных и международныхконференциях, в том числе: 12–м Международном конгрессе по азотфиксации (1999г. Фос–ду–Игуасу, Бразилия), 4–й Европейской конференции по азотфиксации (2000г. Севилья, Испания), 2–м съезде ВОГиС (2000 г., Санкт–Петербург), 5–йЕвропейской конференции по азотфиксации (2002 г.

Норидж, Великобритания), 11–мМеждународном конгрессе по микробно–растительным взаимодействиям (2003 г.Санкт–Петербург), 6–м Международном симпозиуме по структуре и функциямкорней (2003 г., Стара Лесна, Словакия), 3–м съезде ВОГиС (2004 г., Москва), 14–мМеждународном конгрессе по азотфиксации (2004 г.

Пекин, Китай), 1–м симпозиумепо нейробиологии растений (2005 г. Флоренция, Италия), VI съезде ОФР (2007 г.Сыктывкар), 8–й Европейской конференции по азотфиксации (2008 г., Гент, Бельгия),5–м съезде ВОГиС (2009 г. Москва), VII съезде ОФР (2011 г. Нижний Новгород), 7–мМеждународном симпозиуме по структуре и функциям корней (2011 г.

НовыйСмоковец, Словакия), 6–м съезде ВОГиС (2014 г. Ростов–на–Дону), 11–йЕвропейской конференции по азотфиксации (2014 г. Тенерифе, Испания), 3–мМеждународном симпозиуме по сигналлингу и поведению растений (2015 г. Париж,Франция), VIII съезде ОФР (2015 г. Петрозаводск), 4–м Международном симпозиуме9по сигналлингу и поведению растений (2016 г. Санкт–Петербург), 20–мМеждународном конгрессе по азотфиксации (2017 г. Гранада, Испания).Публикации. По материалам диссертации опубликовано 40 статей врецензируемых журналах, из них 40 в рекомендованных ВАК РФ.Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 509 страницах,содержит 114 иллюстраций и 42 таблицы, список литературы включает: 741ссылку, из них 20 отечественных.ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫВ Главе 1 представлен литературный обзор, в котором представленысведения о генетическом контроле клеточных механизмов развития ифункционирования симбиотического клубенька.Глава 2 Материалы и методы исследованияРастительный материал.