Автореферат (Молекулярно–генетические и клеточные механизмы дифференцировки симбиотического клубенька), страница 5

Микротрубочки, тем не менее, остаютсяассоциированными с инфекционными нитями на протяжении всей зоны II.19Рисунок 8. — Схема организации кортикальных и эндоплазматическихмикротрубочек в различных гистологических зонах корня и клубенька угороха и M. truncatulaКортикальныемикротрубочкиобозначенызеленымцветом,эндоплазматические — голубым, симбиотические структуры (инфекционныенити, инфекционные капли, бактерии и симбиосомы) — красным.

Черные шары— ядра. Выделяются два типа организации кортикальных микротрубочек:неупорядоченные перекрещивающиеся и поперечные параллельные (Kitaeva et al.,2016).Наиболее выраженная реорганизация микротрубочек наблюдалась впроцессе выхода бактерий из инфекционных капель в клубеньках как гороха, так иM. truncatula. Плотная сеть, состоящая из пучков эндоплазматическихмикротрубочек различной толщины, окружала инфекционные капли в клубенькахдикого типа (Рисунок 8, 9А, Б) и в мутантных клубеньках с гипертрофированнымиинфекционными каплями, формируемых на корнях мутанта гороха SGEFix––1(Pssym40) (Рисунок 9В, Г) и мутанта efd–1 M.

truncatula в ортологичном гене.Пучки микротрубочек, вероятно, связывали инфекционные капли с перифериейклетки. Таким образом, даже рост гипертрофированных инфекционных капельподдерживался тубулиновым цитоскелетом.В клубеньках ряд клеток остается свободным от бактерий и формирует сетьнеинфицированных клеток с характерной организацией кортикальныхмикротрубочек как у гороха, так и у M. truncatula. В дистальной части зоны II,20неинфицированные клетки все еще имеют перекрещивающуюся ориентациюкортикальных микротрубочек, подобно таковой в меристематических клетках,однако в дальнейшем происходит изменение этого порядка, и в проксимальнойчасти зоны II микротрубочки формируют параллельные, расположенныеперпендикулярно относительно продольной оси клетки пучки, этот порядоксохраняется и в зоне азотфиксации (зоне III) (Рисунок 8).

Сходные измененияпроисходят в клетках корня, которые движутся из меристемы (Baluška et al., 1992)через переходную зону в зону растяжения (Hogetsu, Oshima, 1986; Takahashi et al.,2003; Adamakis et al., 2010) (Рисунок 8). Колонизированные клетки в зоне IIIзаполнены инфекционными нитями и инфекционными каплями, хотя бактерии изних не выходят, порядок кортикальных микротрубочек в этих клетках аналогичентаковому в неинфицированных клетках (Рисунки 8, 10А, Б). Таким образом, вклубеньках организация кортикальных микротрубочек не зависит от присутствияинфекционных структур, таких как инфекционные нити и инфекционные капли.В то же время, в инфицированных клетках в зонах II и III кортикальныемикротрубочки перекрещиваются под разными углами и поддерживаютнерегулярную организацию, характерную для меристематических клеток (Рисунок8).Рисунок 9. — Организация эндоплазматических микротрубочек вокругинфекционных капель в клетках зоны инфекции в клубеньках гороха(А–Г) иммунолокализация тубулина.

(А, Б) Линия дикого типа SGE, (В, Г)мутант SGEFix––1 (Pssym40). (А, В) наложение дифференциально–интерференционного контраста (ДИК), зеленого и красного каналов, (Б, Г)наложение зеленого и красного каналов. Микротрубочки — зеленые, ядра ибактерии — красные. я — ядро; наконечники стрелок указывают на инфекционныекапли, большие стрелки — инфекционные нити, маленькие стрелки указывают на21микротрубочки, ассоциированные с периферией клетки.

Масштабная линейка (А–Г) = 10 мкм.Нами было обнаружено также, что в зоне III может происходить выходбактерий, который мы назвали «вторичным» выходом бактерий, чтобы отличитьего от первичного выхода бактерий, который происходит в зоне инфекции. Втаких клетках в зоне III порядок кортикальных микротрубочек перестраивается отпараллельного к неупорядоченному, как только выход бактерий происходит вклубеньках обоих исследованных видов бобовых растений (Рисунки 8, 10В, Г).Таким образом, мы предположили, что выход бактерий в молодыхинфицированных клетках в зоне II ингибирует перестройку кортикальныхмикротрубочек в параллельный паттерн, и, в случае если выход бактерийпроисходит позже, это может запускать изменение в организации кортикальныхмикротрубочек от параллельного паттерна (свойственного для колонизированныхклеток в зоне III) в неупорядоченный паттерн с перекрещивающимисямикротрубочками, который типичен для клеток, содержащих бактероиды.

Этопредположение было подтверждено с использованием мутанта SGEFix––2(Pssym33), который формирует широкие «запертые» инфекционные нити(Tsyganov et al., 1998), из которых лишь иногда происходит выход бактерий(Voroshilova et al., 2001). В мутантных клубеньках мы наблюдали сдвиг ворганизациикортикальныхмикротрубочекотнеупорядоченнойвмеристематических клетках к поперечным параллельным пучкам в большинствеклеток с инфекционными структурами (Рисунок 10Д), но в отдельных клетках, вкоторых происходил выход бактерий, кортикальные микротрубочки меняли своюориентацию и принимали неупорядоченный паттерн перекрещивающихсямикротрубочек, типичный для меристематических клеток (Рисунок 10Е).

Вклетках клубеньков мутанта M. truncatula TR3 (Mtipd3), в которых не происходилвыход бактерий, ориентация кортикальных микротрубочек была сходной стаковой, которая наблюдалась в клетках без выхода бактерий клубенька SGEFix––2.Полученные результаты с мутантами по ортологичным генам Pssym33 иMtipd3 подтвердили, что данные гены могут прямо, или опосредовано,регулировать реорганизацию кортикальных микротрубочек в клубеньке.

Можнопредположить, что изменение в организации кортикальных микротрубочек можетбыть активировано выходом бактерий, что может быть объясненонеобходимостью для инфицированных клеток изменить их форму и объем дляразмещения огромного количества бактероидов, заполняющих эти клетки.В инфицированных клетках клубеньков Mtdnf1–1, у которого нарушенасубклеточная транспортировка NCR пептидов (Van De Velde et al., 2010) послевыхода бактерий микротрубочки быстро деполимеризовались. Это являетсядополнительным доказательством того, что дифференцировка растительнойклетки тесно связана с дифференцировкой бактерий и/или их функционированием.В то же время, в отличие от клубеньков мутанта Mtdnf1–1, в клубеньках горохаSprint–2Fix– (Pssym31), который несет мутацию в неортологичном гене, но такжехарактеризуется недифференцированными бактероидами (Borisov et al., 1997),микротрубочки формировали плотную сеть, сходно клубенькам дикого типа.22Поэтому можно предположить, что изменения в организации микротрубочекмогут быть связаны со специфичными этапами в дифференцировке бактероидов,или могут отражать межвидовые различия между горохом и M.

truncatula, чтоможет быть проверено, когда станет доступным мутант гороха по гену,ортологичному гену Mtdnf1–1.Рисунок 10 — Организация кортикальных микротрубочек в клетках до ипосле выхода бактерий в клубеньках горохаИммунолокализация (А–Е) тубулина, (А–Г) MAC265. (А, Б, В, Г) линиядикого типа SGE, (Д, Е) мутант SGEFix––2 (Pssym33). (А, Б, Д) до выходабактерий, (В, Г, Е) после выхода бактерий. (А, В) наложение ДИК, зеленого,красного и желтого каналов, (Б, Г) наложение зеленого, красного и желтогоканалов, (Д, Е) наложение зеленого и красного каналов. Микротрубочки —зеленые, ядра и бактерии — красные, инфекционные капли, меченные антителомMAC265 — желтые.

Наконечники стрелок указывают инфекционные капли,23стрелки — инфекционные нити, короткие наконечники стрелок —высвобождающуюся бактерию, звездочка — вышедшие бактерии. Масштабнаялинейка (А–Е) = 10 мкм.В зоне азотфиксации клубеньков M. truncatula эндоплазматическиемикротрубочки были хорошо различимы, они располагались параллельнобактероидам. В то же время в клубеньках гороха эндоплазматическиемикротрубочки не претерпевали реорганизацию и не формировали упорядоченныйпаттерн в тесном контакте с бактероидами.

Данная клеточная организация,наблюдаемая в клубеньках гороха, была описана для клубеньков люпина (Fedorovaet al., 2007) и сои (Whitehead et al., 1998) и, таким образом, является более общимтипом организации микротрубочек в зоне азотфиксации.3.10. Анализ роль этилена в реализации ранних и поздних этаповгенетической программы симбиогенеза у горохаИнгибиторы действия и синтеза этилена (Ag+ и аминоэтоксивинилглицином(АВГ)) приводили к увеличению числа формируемых клубеньков у мутанта К5(Pssym12) до уровня дикого типа, а обработка этефоном и предшественникомэтилена в его биосинтезе (1–аминоциклопропан–1–карбоновой кислотой (АЦК)),напротив, полностью ингибировала способность к клубенькообразованию, в товремя как у дикого типа этефон и АЦК лишь уменьшили число формируемыхклубеньков (Рисунок 11).

При изучении развития инфекции у мутанта К5(Pssym12) было показано, что часть инфекций блокируется на ранних этапахформирования примордия, большинство инфекций останавливаются послеформирования зрелого примордия, на стадии формирования клубеньковоймеристемы, в том случае, когда редкие инфекции успешно развиваются,формирующиеся клубеньки характеризуются нормальной гистологическойорганизацией. Таким образом, показано, что мутантная линия K5 (Pssym12),блокированная на стадии формирования меристемы зрелого клубенька,характеризуется повышенной чувствительностью к этилену. С использованиемиммунолокализации АЦК было показано, что этилен негативно регулируетразвитие инфекционной нити в коре корня, а также необходим дляфункционирования меристемы зрелого клубенька.

Негативная регуляция этиленомразвития инфекционной нити была показана ранее (Guinel, Larue, 1991; Guinel,Sloetjes, 2000). В то же время роль этилена в регуляции функционированиямеристемы в недетерминированном клубеньке показана впервые.24Рисунок 11. — Влияние этилена на развитие клубеньков у дикого типа Rondoи мутанта K5 (Pssym12)3.11. Анализ роли нитратов в реализации генетической программысимбиогенеза у гороха и L. japonicusГен PsSym31, мутации в котором приводят к фенотипу Fix–, былидентифицирован как единственный к настоящему моменту симбиотический генгороха, одновременно контролирующий дифференцировку симбиотическихкомпартментов и нитрат–зависимую регуляцию клубенькообразования. Для L.japonicus также были выявлены Fix– мутанты, характеризующиесянечувствительностью клубенькообразования к ингибирующему действиюнитратов.3.12.