Автореферат (Молекулярно–генетические и клеточные механизмы дифференцировки симбиотического клубенька), страница 4

Ранее Ccd– фенотип был описан для мутантов по генам Pssym8,Pssym9, Pssym10, Pssym19 и Pssym30, которые также были блокированы на самойранней стадии инфекции — Hac– фенотип (Markwei, Larue, 1992; Sagan et al.,1994).Таким образом, у гороха, по крайней мере, 8 локусов необходимы дляинициации делений в коре корня, но сами деления коры корня не являютсянеобходимыми для индукции скручивания корневых волосков и последующейколонизации корневого волоска. У мутантов по гену Pssym34 инициируютсяначальные клеточные деления коры, но они вскоре останавливаются иклубеньковый примордий не формируется (Npd– фенотип).

Ранее сходныйфенотип был описан для мутантов E2 по гену Pssym5 (Guinel, Larue, 1991) и R50по гену Pssym16 (Guinel, Sloetjes, 2000). У мутантов по генам Pssym37 и Pssym38клубеньковый примордий формируется, но у этих мутантов блокировано развитиеклубеньковой меристемы (Nmd– фенотип). Сходный фенотип наблюдался длялиний гороха афганского происхождения, несущих аллель Pssym2A (Geurts et al.,1997) и мутанта DK24 (Pssym36) (Sagan et al., 1994).Таким образом, у гороха, по крайней мере, 3 локуса (PsSym5, PsSym16 иPsSym34) контролируют развитие клубенькового примордия и 4 локуса (PsSym2,PsSym36, PsSym37 и PsSym38) необходимы для развития клубеньковой меристемы.Проведенная нами фенотипическая характеристика большого набора Nod–мутантов гороха позволила классифицировать симбиотические гены всоответствии со стадией развития клубенька, которую они контролируют. Такжепредложенасхемапоследовательностифункционированияраннихсимбиотических генов гороха на основе результатов, полученных в данной работе,и данных литературы (Рисунок 3).14Рисунок 3.

— Схема последовательности функционированиясимбиотических генов гороха, вовлеченных в контроль инфекции иорганогенеза клубенькаРисунки с последовательными стадиями подпрограммы инфекции корняризобиями помещены с левой стороны и соединены голубыми стрелками (клеткирастений обозначены желтым цветом, бактерии — голубым). Рисункипоследовательных стадий подпрограммы органогенеза клубенька связаныоранжевыми стрелками и помещены на правой стороне (клетки коры корня15обозначены желтым цветом, делящиеся клетки — оранжевым, клетки перциклаобозначены утолщенными клеточными стенками, клетки меристемы — краснымцветом).

Гены, контролирующие различные стадии развития клубенька, помещеныв центр рисунка. Гены, контролирующие инфекционный процесс, ифенотипические коды, соответствующие стадиям его развития, обозначеныголубым. Гены, контролирующие органогенез клубенька, и фенотипические коды,соответствующие стадиям его развития, обозначены оранжевым, гены,вовлеченные в оба процесса, — зеленым.

Возможные блоки развитиямаркированы перекрестием и стрелками от гена или группы генов,контролирующих соответствующую стадию. Стрелки от генов к стадиямокрашены цветом, соответствующим процессу, (голубой для инфекционногопроцесса и оранжевый для органогенеза). 3 точки проверки регуляторнойобратной связи между двумя процессами и стрелки, показывающиепредполагаемые связи между ними, маркированы следующим образом: отподпрограммы органогенеза — пурпурным цветом (номера 1, 2 и 3 того же цвета)и от подпрограммы инфекции — фиолетовым цветом (номер 1 того же цвета)(Tsyganov et al., 2002).3.6.

Идентификация гена гороха, ортологичного гену лядвенца LjNIN,являющегося первым клонированным геном бобовых растений и ключевымрегулятором симбиогенеза на ранних стадияхМутанты по гену Pssym35 характеризовались наибольшим фенотипическимсходством с мутантами по гену Ljnin: у них не индуцировались клеточные деленияво внутренних слоях коры и наблюдалось сильно увеличенное, по сравнению сдиким типом, число скрученных волосков.

Это позволило считать ген PsSym35наиболее вероятным кандидатом на роль ортолога гена LjNin. В результатеанализа микросинтении между горохом L. japonicus у гороха был выявлен генPsNin, ортологичный гену LjNin. Для того, чтобы подтвердить, что ген PsSym35является PsNin, область размером примерно 4000. п.н., покрывающая все экзоны иинтроны PsNin была амплифицирована и секвенирована у 3–х аллельных мутантовпо гену Pssym35: SGENod––1, SGENod––3, RisNod8.

У всех 3–х мутантов быливыявлены единичные нуклеотидные замены в гене PsNin, по сравнению споследовательностями соответствующих генотипов дикого типа SGE и Finale(Рисунок 4). Клонирование гена PsSym35 на основе гомологии с геном LjNinявилось одним из первых примеров использования методологии клонированиягенов хозяйственно-ценных бобовых растений на основе анализа микросинтенииих геномов с геномами модельных бобовых растений (Borisov et al., 2003).16Рисунок 4.

— Структура аллелей дикого типа и мутантов у ортологичныхгенов LjNin и Pssym353.7. Анализ роли арабиногалактанпротеин–экстензинов в реализациигенетической подпрограммы инфекции тканей клубенька ризобиями у горохаАрабиногалактанпротеин–экстензины являются основным компонентомматрикса инфекционных структур (инфекционных нитей и капель) как приразвитии эффективного, так и неэффективного симбиоза у гороха. В то же время умутантапогенуPssym40наблюдаласьаномальнаясекрецияарабиногалактанпротеин–экстензинов не только в матрикс инфекционныхструктур, но и в межклеточное пространство (Рисунок 5).Рисунок 5. — Иммунолокализация арабиногалактанпротеин–экстензиновВыявление с помощью антител МАС265.

А — линия дикого типа SGE; Б —мутантная линия SGEFix––1 (Pssym40). ик — инфицированная клетка, ин —инфекционная нить, ика — инфекционная капля, звездочка указывают налокализацию МАС265 в межклеточном пространстве у мутантной линии SGEFix––1.173.8. Анализ роли пероксида водорода в реализации генетическойподпрограммы инфекции тканей клубенька ризобиями у горохаВ клубеньках гороха дикого типа пероксид водорода был ассоциирован состенками инфекционных нитей и клеточными стенками, матриксоминфекционных нитей и капель, в то же время он не детектировался в симбиосомах(Рисунок 6).

В стареющих клубеньках наблюдалась аккумуляция пероксидаводорода вокруг деградирующих бактероидов, в стенке и матриксе инфекционнойнити и матриксе инфекционной капли (Рисунок 6). Аналогичное распределениепероксида водорода наблюдалось ранее в клубеньках люцерны, гороха, сои (Rubioet al., 2004; Kopcińska, 2009). В то же время у всех проанализированных мутантовнаблюдались аномалии в локализации пероксида водорода. Для мутанта SGEFix––1 (Pssym40) было характерно присутствие пероксида водорода вокруг ювенильныхбактероидов (Рисунок 7), для RisFixV (Pssym42) — вокруг преждевременностареющих бактероидов, у мутанта SGEFix––2 (Pssym33) — вокруг утолщенныхстенок инфекционных нитей.

Такое аномальное распределение пероксида в этихмутантах, вероятно, связано с активацией в этих мутантах сильных защитныхреакций (Ivanova et al., 2015).Рисунок 6. — Локализация пероксида водорода в симбиотических клубенькахгороха дикого типа SGE(А–В) последовательные стадии накопления пероксида водорода винфекционной нити от внутренней стенки инфекционной нити. (А) через всютолщину стенки инфекционной нити (Б-В) с последующим отложением в матриксеинфекционной нити.

(Г) отложение пероксида водорода в матриксе инфекционнойкапли. (Д) отсутствие пероксида водорода в инфицированной клетке рядом ссимбиосомами (Е) отложение пероксида водорода в стареющих инфицированныхклетках: вокруг бактероидов. Пероксид водорода откладывается в видеэлектронно–плотных преципитатов пергидроксида церия (показаны стрелками). ин— инфекционная нить, инк — инфекционная капля, б — бактерия, ба —бактероид, дба — деградирующий бактероид.

Масштабная линейка = 500 нм.18Рисунок 7. — Локализация пероксида водорода в симбиотических клубенькахгороха мутанта SGEFix––1 (Pssym40)(А) накопление пероксида водорода в стенке инфекционной нити. (Б)накопление пероксида водорода в матриксе инфекционной нити и вокругбактерий.(В)отложениепероксидаводородавокругювенильныхдифференцирующихся бактероидов. Пероксид водорода откладывается в видеэлектронно–плотных преципитатов пергидроксида церия (показаны стрелками). ин— инфекционная нить, б — бактерия, юба — ювенильный бактероид. Масштабнаялинейка = 500 нм.3.9. Анализ роли реорганизации тубулинового цитоскелета вдифференцировке клеток симбиотических клубеньков гороха и M.

truncatulaпри реализации поздних этапов генетической программы симбиогенезаБыл проведен сравнительный анализ организации тубулинового цитоскелетав клубеньках двух родственных видов клады Galegoid: M. truncatula и P. sativum. Уобоих видов в меристеме клубеньков перинуклеарные микротрубочки окружаютядро и связывают его с периферией клетки, при этом кортикальныемикротрубочки расположены неупорядоченно. Данный тип организациимикротрубочек не отличается от таковой в клетках меристемы корня (Baluška etal., 1992) (Рисунок 8).В зоне инфекции (зоне II) инфекционные нити активно развиваются иветвятся, во многих клетках формируются инфекционные капли, из которыхбактериивысвобождаютсяврастительныеклеткиипостепеннодифференцируютсявазотфиксирующиебактероиды.Микротрубочкихарактеризовались определенной организацией на каждой из этих стадий (Рисунок8). Как в корневых волосках, так в клубеньках микротрубочки могут образовыватьформу, в которой строится инфекционная нить, но в клубеньках, по–видимому,микротрубочки не подготавливают клетки для инфекции и не контролируютнаправление роста инфекционной нити.