Диссертация (Анеуплоидия как механизм обратимого изменения супрессорного фенотипа (ISP) у дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 8

[PSI + ] (исходно названный фактором Ψ)был обнаружен как приводящая к нонсенс-супрессии мутация с неменделевскимхарактером наследования (в мейотическом потомстве диплоида, полученного отскрещивания штаммов [PSI + ] и [psi– ], наблюдали расщепление 4:0, в отличие отожидаемого расщепления 2:2 в случае обычной мутации) и цитоплазматическойлокализацией, показанной с помощью цитодукции (Cox et al., 1988).

Вместе стем, было показано, что поддержание [PSI + ] зависит от одного ядерного гена(Tuite, Cox, 1980). Мутации со сходным фенотипом (омнипотентные нонсенссупрессоры) были обнаружены независимо несколькими группами исследователей (Инге-Вечтомов, Андрианова, 1970; Hawthorne, Leupold, 1974; Gerlach,1975; Crouzet, Tuite, 1987). Позже было показано, что во всех этих работах былиизучены мутанты по гену SUP35.Фактор [URE3] был открыт при изучении биосинтеза урацила как доминантная мутация ure-3 с неменделевским наследованием, причём ранее в том желокусе были описаны две менделевски наследуемые мутации (Lacroute, 1971).Одна из этих мутаций, ure-2, оказалась неспособной к поддержанию детерминанта [URE3], хотя проявляла сходный фенотип (Aigle, Lacroute, 1975).Природа детерминантов [URE3] и [PSI + ] долго оставалась непонятной.

Затем появились сведения о том, что [PSI + ] можно обратимо элиминировать привыращивании клеток на среде, содержащей некоторые химические вещества, втом числе гидрохлорид гуанидина (GuHCl), и тепловом шоке (Tuite et al., 1981).Вскоре была показана связь [PSI + ] с геном SUP35, а именно возникновение этого фактора при сверхэкспрессии SUP35 (Chernoff et al., 1993), и ключевая рольN-концевой части белка в этом процессе (Ter-Avanesyan et al., 1993).

На основеэтих данных и аналогичных экспериментов с детерминантом [URE3] Р. Викнер(Reed Wickner) выдвинул предположение о прионной природе детерминантов[PSI + ] и [URE3] (Wickner, 1994), а также предложил следующие критерии дрожжевых прионов (см. Wickner, 1996):1. Прионы подвергаются обратимому излечиванию. Под этим термином подразумевают потерю приона при выращивании дрожжей на среде, содержащей GuHCl, и появление клеток с прионом с ненулевой вероятностью послеокончания воздействия.392.

Сверхэкспрессия гена, кодирующего прионный белок (такой ген называют структурным геном соответствующего приона), повышает частоту появления приона. Предполагают, что этот эффект связан с тем, что переходмолекулы белка из нормальной конформации в прионную является вероятностным процессом: чем больше молекул такого белка в клетке, тем вышевероятность образования так называемого «ядра» прионизации (prion seed).3.

Структурный ген приона необходим для поддержания последнего: (i) приинактивации этого гена прион теряется через некоторое количество клеточных поколений, потому что заканчивается доступный для перевода в прионную форму белок, а (ii) фенотип клеток, несущих прион, схож с фенотипоммутантов по его структурному гену.«Излечивание» прионов под воздействием GuHCl связано с чувствительностью шаперона Hsp104, основного участника комплекса шаперонов, необходимых для поддержания прионов, к этому веществу. Следует отметить, что активность Hsp104p необходима именно для поддержания [PSI + ], но не для агрегацииSup35p (см. Romanova, Chernoff, 2009).

К потере приона [PSI + ] приводит нетолько инактивация, но и сверхпродукция Hsp104, однако большинство другихприонов нечувствительно к такому воздействию (см. Crow, Li, 2011; Suzuki etal., 2012; Halfmann et al., 2012b).Обнаружение приона [PIN + ] связано с изучением способности штаммов кповторной индукции [PSI + ] после его изгнания, происходящей с высокой частотой при сверхэкспрессии SUP35. Эта способность, названная фенотипом Pin+(от англ. [PSI + ] inducibility, способность к индукции [PSI + ]), зависит от способаизгнания [PSI + ]: временная сверхэкспрессия HSP104 не лишала штаммы этойспособности, а пассирование клонов на среде с GuHCl приводило к появлениюне способных к индукции [PSI + ] клонов, причём чем выше была концентрацияGuHCl в среде, тем реже отобранные клоны были способны к последующей индукции [PSI + ] (Derkatch et al., 1997).

Было высказано предположение, что фенотип Pin+ контролируется фактором прионной природы, который не излечиваетсяпри сверхэкспрессии HSP104 (Derkatch et al., 1997). Последующие исследования позволили показать, что функцию [PIN + ] способны выполнять продукты 11разных участков дрожжевого генома, в том числе уже известный прионогенный40белок Ure2p (Derkatch et al., 2001), однако настоящим детерминантом [PIN + ] является белок Rnq1 (Derkatch et al., 2001), прионогенные свойства которого былинезависимо изучены незадолго до этого (Sondheimer, Lindquist, 2000), а биологические функции не вполне понятны до сих пор (см. Stein, True, 2011).

Интересно,что производные штамма S288C оказались [PIN + ] (Sondheimer, Lindquist, 2000;Manogaran et al., 2010). Прион [PIN + ] достаточно часто встречается в штаммах не лабораторного происхождения (11 из 70 штаммов в работе Nakayashikiet al., 2005 и 43 из 690 штаммов в работе Halfmann et al., 2012a). Возможно, чтоагрегаты Rnq1p являются универсальным фактором, необходимым для прионизации других белков (см.

Chernova et al., 2014). Впоследствии с использованиемразных методов был открыт ряд других прионов и прионоподобных факторовS. cerevisiae (табл. 1.4).Последующая проверка других кандидатов, выявленных при поиске структурного гена [PIN + ], привела к обнаружению прионов [SWI + ] (Du et al., 2008) и[OCT + ] (Patel et al., 2009). Способность других прионогенных белков заменять[PIN + ] была использована для разработки системы поиска новых прионов, чтопозволило выявить прион [MOD+ ] (Suzuki et al., 2012).Наконец, некоторые прионы были выявлены при проверке потенциально прионогенных белков; для формирования спискаHarrison &Gerstein(172)29Michelitsch &Weismann2 (107)3таких белков использовали особенности их73аминокислотной последовательности. Белки Sup35, Ure2 и Rnq1 cодержат обогащённые остатками глутамина и аспарагина (Q/N-богатые) домены, которые и отвечают за их агрегацию. При первом систематическом анализе последовательностей дрож-392676Alberti et al.(178)Рисунок 1.10 — Пересечение списковжевых белков прионогенными считали бел- потенциально прионогенных белковки, содержащие участки, где из 80 остатков S.

cerevisiae. По материалам Michelitsch,Weissman, 2000; Harrison, Gerstein, 2003;аминокислот не менее 30 являются остатка- Alberti et al., 2009; см. Drozdova,Matveenko, 2015.ми аспарагина или глутамина (Michelitsch,Weissman, 2000). Позже были проведены ещё два подобных больших исследования (Harrison, Gerstein, 2003; Alberti et al., 2009) с более сложными алгоритмами,41однако интересно отметить, что результаты всех этих исследований схожи (рис.1.10). При анализе Q/N-богатых кандидатов были обнаружены прионы [MOT3+ ](Alberti et al., 2009) и [NUP100+ ] (Halfmann et al., 2012b).Некоторые из новых прионов были открыты, подобно [PSI + ] и [URE3], какнеменделевски наследуемые доминантные мутации: [ISP+ ] (Volkov et al., 2002),[GAR+ ] (Brown, Lindquist, 2009), [NSI + ] (Saifitdinova et al., 2010).

Такой способпоиска прионов усложнил их изучение, поскольку в каждом случае были необходимы дополнительные эксперименты для поиска структурного гена приона.[GAR+ ] является крайне нетипичным дрожжевым прионом: его поддержание независит от Hsp104p и не ингибируется GuHCl, но зависит от активности шаперона Ssa1 (Brown, Lindquist, 2009). Недавно при систематическом поиске фенотипов, вызываемых сверхэкспрессией какого-либо гена и сохраняющихся послеокончания сверхэкспрессии, был обнаружен целый ряд детерминантов, образуемых в основном не Q/N-богатыми белками и различающихся по шаперонам,необходимым для их поддержания (Chakrabortee et al., 2016).

Эти данные позволяют предположить, что феномен белковой наследственности шире представления об амилоидных прионах. Существует гипотеза, что случайный переходбелка в прионную форму в части клеток из популяции может быть временнымспособом приспособиться к неблагоприятным условиям, поскольку, в отличиеот мутаций, не требует деления клеток (см. Newby, Lindquist, 2013).Далее мы рассмотрим прионы, связанные с контролем эффективности терминации трансляции.1.4.2.

Связь [PSI + ] с терминацией трансляцииСвязь приона [PSI + ] с терминацией трансляции наиболее очевидна: он образован одним из двух главных участников этого процесса, белком Sup35. Согласно классической точке зрения, супрессия, вызываемая [PSI + ], связана с тем,что в клетках [PSI + ] значительная доля молекул Sup35p вовлечена в агрегаты,поэтому снижено число комплексов факторов терминации трансляции.

Поэтому в конкуренции, существующей между комплексами факторов терминациитрансляции и эндогенными супрессорными тРНК, в клетках [psi– ] преимуществом обладают первые, а в клетках [PSI + ] — вторые (Haar, Tuite, 2007). Недавно42было показано, что механизм несколько сложнее: Sup35p в составе небольшихагрегатов также может участвовать в терминации трансляции (Pezza et al., 2014).1.4.3. [NSI + ] и терминация трансляции[NSI + ] (от англ. Nonsense Suppression Inducer) — прионоподобный детерминант, обнаруженный в штаммах, продуцирующих вместо белка Sup35 химернуюконструкцию Аβ-Sup35MC. Фенотипический эффект присутствия [NSI + ] заключается в появлении нонсенс-супрессии, пропадающей при инактивации Hsp104p(Saifitdinova et al., 2010).

Поиск структурного гена [NSI + ] с помощью генетических методов позволил обнаружить ряд генов, уровень экспрессии которыхвлияет на проявление [NSI + ], однако настоящий ген-детерминант этого прионаобнаружить не удалось (Nizhnikov et al., 2012). С помощью биохимическогометода анализа амилоидов удалось выяснить, что детерминант [NSI + ] формируется при одновременном присутствии в клетке прионов [SWI + ] и [PIN + ], причёмдля эффективной супрессии проявления мутации ade1-14 нужны оба приона, асупрессию проявления второй изученной нонсенс-мутации, trp1-289, определяетналичие [SWI + ] (Галкин, 2015).

Фенотипическое проявление [NSI + ] формируетсяза счёт снижения уровня транскрипции гена SUP45 и уровня Sup45p (Кондрашкина и др., 2014).1.4.4. MOD5, [MOD+ ] и терминация трансляцииПрион [MOD+ ] образован белком Mod5, тРНК-изопентенилтрансферазой,которая переносит изопентенильную группу на аденин антикодоновой петлитРНК, а также регулирует биосинтез эргостеринов через изменение уровня своего субстрата. Хотя Mod5p принимает участие в контроле эффективности терминации трансляции (см. раздел 1.3.2), связь между [MOD+ ] и трансляцией неизучена.431.4.5. [ISP + ]Обнаружение [ISP+ ] связано с работой по отбору омнипотентных супрессоров при одновременной реверсии к прототрофности по аденину и гистидинув штамме 2В-П3982, несущем нонсенс-мутации ade1-14 (UGA), his7-1 (UAA) иlys2-87 (UGA) (рис.