Диссертация (Анеуплоидия как механизм обратимого изменения супрессорного фенотипа (ISP) у дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 3

В некоторых исследованиях, целью которых было выявление эволюционных связей между разными (природными и лабораторными) штаммамидрожжей (Liti et al., 2009; Bergström et al., 2014), авторы отдали предпочтение количеству данных в ущерб качеству анализа индивидуальных образцов ипользовались сложными статистическими методами анализа для предсказаниянастоящих последовательностей при объединении нескольких образцов, полученных из родственных штаммов.Тем не менее, накопленные в результате секвенирования большого числаштаммов данные позволили утверждать, что число однонуклеотидных замен, отличающих штаммы S.

cerevisiae друг от друга, относительно невелико по сравнению с близкими видами (Bergström et al., 2014), а также дали возможностьвысказать гипотезу о том, что эти различия могут быть связаны с тем, что разнообразие геномов разных штаммов S. cerevisiae создаётся в большей степени неза счёт нуклеотидных замен, а за счёт хромосомных перестроек (Bergström et al.,2014).

Хотя эта гипотеза нуждается в дополнительной проверке, из имеющихся данных следует не менее двух важных выводов. Во-первых, относительнонебольшое разнообразие последовательностей генов оправдывает использование плазмид, полученных из геномной ДНК одного штамма, для исследованиямутаций в неродственном штамме.

Во-вторых, относительно высокая частотахромосомных перестроек может объяснять существование репродуктивного барьера между некоторыми штаммами.Вид S. cerevisiae обладает достаточно высокой экологической пластичностью и может обитать в разных экологических нишах, однако обычно эти нишисвязаны с человеком (см. Legras et al., 2007). В лабораторной практике исполь-13зуют штаммы S. cerevisiae разного происхождения, которые можно условно разделить на три группы.1. Многие лабораторные штаммы восходят к Карбондэйлским генетическимлиниям, основанным К.

Линдегреном, и появились в результате сложных скрещиваний, в которых участвовали разные виды Saccharomyces, однако большая часть генетического материала их штаммов принадлежитS. cerevisiae (см. Lindegren, 1949; Mortimer, Johnston, 1986; Engel et al.,2014). К таким штаммам относится в том числе S288C, источник первогосеквенированного генома (см. Engel et al., 2014), и полученные на его основе штаммы BY4741 и BY4742 (Winston et al., 1995; Brachmann et al.,1998).2. Кроме того, используют штаммы сложного гибридного происхождения, полученные в результате многократных возвратных скрещиваний с S288C илидругими штаммами первой группы, такие как W303 (см. Ralser, Kuhl, 2012),YPH499 (Sikorski, Hieter, 1989) или группа штаммов CEN.PK (см. Entian,Kötter, 2007). Эти штаммы в разной степени схожи с S288C: например,геномы CEN.PK113-7D и S288C отличаются друг от друга 22 тыс.

однонуклеотидных замен (Nijkamp et al., 2012), а в случае W303 и S288C различиесоставляет около 8 тыс. (Ralser, Kuhl, 2012). Определить точную степеньродства каждого из этих штаммов со штаммом S288C не представляетсявозможным.3. Наконец, существуют лабораторные штаммы, значительная часть генома которых принадлежит независимым от S288C клиническим или промышленным изолятам. Среди первых в качестве лабораторного штамма наиболееактивно используется YJM789, гаплоидный потомок клинического изолята(Tawfik et al., 1989; Wei et al., 2007).

Примером потомков промышленных дрожжей могут служить H-42, гаплоидный потомок штамма, используемого для производства саке (Toh-E et al., 1973), или 15В-П4, происходящий от дрожжей, используемых в производстве спирта (Инге-Вечтомов,1963). 15В-П4 был использован в скрещиваниях, давших начало Петергофским генетическим линиям (ПГЛ). ПГЛ — это группа родственных междусобой дрожжевых штаммов, происходящих от гетероталличного производного XII производственной расы, полученного на кафедре генетики ЛГУ14С.

Г. Инге-Вечтомовым (Инге-Вечтомов, 1963). В изучении дрожжевых прионов широко используют производные штамма 74-Д694, который являетсяпотомком скрещиваний штаммов ПГЛ и штамма DBY474 из лабораторииД. Ботстайна (David Botstein; Botstein et al., 1979). Штаммы этой группы отдалённо родственны S288C: например, YJM789 отличается от S288Cпо нуклеотидам в 60 тыс. позиций (Wei et al., 2007), 15В-П4 — в 46 тыс.(Drozdova et al., 2016), а 74-Д694 — в 24–26 тыс.

позиций (Fitzpatrick et al.,2011; Drozdova et al., 2016).Следует отметить, что в то время как ряд штаммов используют повсеместно, некоторые другие применяют в отдельных областях. Иногда выбор обусловлен объективными особенностями штамма (например, производный YJM789 впаре с производным W303 удобно использовать для изучения рекомбинации, поскольку последовательности их геномов различаются приблизительно по 60 тыс.позиций, разбросанных по всему геному; Lee et al., 2009), а иногда определёнтрадицией. Например, поскольку многие ключевые эксперименты по изучениюприонов [PSI + ] и [PIN + ] были сделаны с использованием производных штамма 74-Д694 (например, Chernoff et al., 1995; Derkatch et al., 1996; Derkatch etal., 2001), этот и родственные ему штаммы продолжают широко использовать визучении дрожжевых прионов (Du et al., 2008; Suzuki et al., 2012).Жизненный цикл S.

cerevisiae включает гаплоидную и диплоидную фазы,соотношение длительности которых зависит от типа штамма. Природные штаммы обычно гомоталличны, что означает, что гаплоидные клетки могут переключать тип спаривания и сливаться с другими клетками того же клона, образуя стабильные диплоидные клоны(см. Lee, Haber, 2015). Большинство лабораторныхштаммов являются гетероталличными, т. е. не способны к переключению типаспаривания, поэтому их можно стабильно поддерживать как в диплоидном, таки в гаплоидном состоянии, а также направленно скрещивать (рис.

1.1А). Гетероталличные штаммы обычно дефектны по гену HO, продукт которого необходим для переключения типа спаривания (рис. 1.1Б; см. Инге-Вечтомов, Карпова,1993; Duina et al., 2014), но могут переключать тип спаривания при введениигена HO на плазмиде (Parent et al., 1985). Продукт этого гена, эндонуклеаза HO,продуцируется в материнской клетке в течение краткого промежутка времени встадии G1 и вносит в ДНК двунитевой разрыв, репарация которого происходит15с использованием материала кассеты HMLα или HMRa.

Эти последовательностиДНК содержат необходимые для формирования соответствующего типа спаривания гены, но не подвергаются транскрипции, поскольку расположены в областигетерохроматина (см. Lee, Haber, 2015).АБaHMLαПMATaHMRaКлетка aαIIIЭндонуклеаза HO2α: 2aa/αHMLαМейозMATαHMRaКлетка αIIIРисунок 1.1 — Клеточный цикл S. cerevisiae (А) и участки генома, несущие необходимуюдля определения типа спаривания информацию (Б).

П — переключение типа спаривания.1.2. Общие сведения о процессе трансляции у дрожжей S. cerevisiaeОдин из наиболее энергоёмких процессов в большинстве живых клеток —это синтез полипептидной цепи на матрице мРНК, или трансляция. В процессетрансляции принято выделять четыре этапа: инициацию, элонгацию, терминацию и рециклирование рибосом (иногда два последних объединяют). На первомэтапе, инициации, происходит сборка комплекса из двух субъединиц рибосомы,мРНК и инициаторной метионил-тРНК, предположительно связанной в P-сайте рибосомы.

Во время элонгации в A-сайт рибосомы входят аминоацил-тРНК(аа-тРНК), антикодоны которых оцениваются на предмет комплементарности кодону мРНК, и в случае правильного спаривания кодона и антикодона рибосомакатализирует образование пептидной связи, присоединяя к пептиду новую аминокислоту. После этого комплекс тРНК, пептида и мРНК продвигается на одинкодон, освобождая в A-сайте место для подхода следующей тРНК, и процесс повторяется.

Когда в A-сайт попадает стоп-кодон, с ним связывается комплекс факторов терминации трансляции, после чего происходит гидролиз эфирной связи16между полипептидом и тРНК, находящейся в этот момент в P-сайте рибосомы.Наконец, на последнем этапе, рециклировании, происходит диссоциация субъединиц рибосомы от мРНК, а также высвобождение деацилированной тРНК (см.Kapp, Lorsch, 2004; Dever, Green, 2012; Dever et al., 2016).1.2.1.

Состав рибосомы и регуляция синтеза компонентов рибосомыЦентральные процессы в биосинтезе белка — оценка комплементарностиантикодона тРНК кодону мРНК и образование пептидной связи — обеспечиваются рибосомой (см. Woolford, Baserga, 2013). В активно делящихся дрожжевыхклетках содержится около 200 тыс. рибосом (Warner, 1999; Haar, 2008; Firczuket al., 2013), которые синтезируют 13 тыс. молекул белка в минуту (Haar, 2008).Каждая рибосома состоит из двух субъединиц, которые объединяются только вмомент трансляции. Малая (40S) субъединица состоит из одной молекулы рРНК(18S) и 33 молекул белков, в то время как большая (60S) субъединица включаеттри молекулы рРНК (5S, 5,8S и 25S) и 46 белков (см.