Диссертация (Анеуплоидия как механизм обратимого изменения супрессорного фенотипа (ISP) у дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 11

Для определениячувствительности к недостатку ионов железа использовали среду YEPD с добавлением дисульфоната батофенантролина (BPS; Bathophenanthroline-disulfonicacid disodium salt hydrate, Sigma) — хелатора ионов железа — в концентрации140 мкМ (Davis-Kaplan et al., 2004; концентрацию BPS подбирали экспериментально); для определения чувствительности к избытку ионов железа — средуSMC со всеми указанными добавками и FeSO4 x6 H2 O в концентрации 20 мМ.Все селективные среды содержали 20 г/л глюкозы, а все твёрдые среды — 20 г/лагара.Для оценки оптической плотности культуры дрожжевых клеток использовали планшетный спектрометр iMark (Bio-Rad) со светофильтром 595 нм; вкаждую ячейку 96-луночного планшета добавляли 280 мкл суспензии клетокили контрольной жидкости. Для расчёта концентрации клеток в культуре использовали соотношение 1 ODU595 = 2,5×107 клеток/мл, определённое экспериментально.Для выращивания клеток E.

coli использовали среду LB (Sambrook et al.,1989). Для трансформации клеток E. coli использовали компетентные клетки,подготовленные по методу Inoue et al., 1990. Для отбора трансформантов илиподдержания плазмиды при выращивании трансформированных клеток в средуLB добавляли 100 мг/л ампициллина или 50 мг/л канамицина, а для визуальной детекции колоний, не имеющих активности бета-галактозидазы, — 200 мг/л5-бромо-4-хлоро-3-индолил-β-D-галактопиранозида (X-Gal) и 100 мкМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) (Sambrook et al., 1989).552.3.

Методы генетики дрожжейВ работе использованы стандартные методы генетики дрожжей (Захарови др., 1984; Kaiser et al., 1994). Кроме того, для точной оценки роста дрожжевых штаммов использовали метод посева с разведениями. Для этого клеткисо штриха ресуспендировали в стерильной дистиллированной воде или клеткииз жидкой культуры промывали и ресуспендировали в дистиллированной воде;затем концентрацию клеток выравнивали, доводя приблизительно до 5×107 –108клеток/мл. Затем по 6 мкл каждого из шести последовательных пятикратныхразведений высевали на контрольную и селективные среды.Трансформацию дрожжевых клеток проводили с использованием ацетаталития и балластной ДНК согласно протоколу, описанному в статье Gietz et al.,1992, с некоторыми изменениями: в случае штаммов с мутацией sup35-25 длятеплового шока использовали инкубацию при температуре 37 °C, а для получения колоний трансформантов чашки инкубировали при температуре 26 °C втечение 6–7 дней.

В случае трансформации ПЦР-продуктом клетки после теплового шока и перед высевом на твёрдую среду ресуспендировали в 1 мл жидкойсреды YEPD и инкубировали в течение часа при 26 °C для увеличения эффективности трансформации.2.4. Методы микроскопииДля оценки комкования использовали жидкую культуру в логарифмической стадии роста (ночную культуру разбавляли свежей средой YEPD и выращивали в течение 4 часов). Фотографии получали с помощью фотонасадки ZeissAxiocam ERc s5 для микроскопа Zeiss Primostar. Для оценки размера клеток использовали фотографии сетки камеры Горяева.Временные препараты для флуоресцентной микроскопии получали смешиванием жидкой культуры дрожжевых клеток в среде SC-Ura на логарифмическойстадии роста (около 5×106 клеток/мл) с 50% глицерином в соотношении 1:1.

В56случае окраски ДНК 4’,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) суспензию клетоксмешивали со средой для заключения препаратов Prolong Antifade with DAPI(Invitrogen) согласно инструкции производителя. Использовали микроскоп ZeissAxioScope.A1; для визуализации Swi1-YFPp использовали фильтр 46 (максимумвозбуждения — 500 нм, максимум испускания — 535 нм), для отделения автофлуоресценции от флуоресценции Swi1-YFPp — фильтр 74HE (максимумы возбуждения — 483 нм и 569 нм; максимумы испускания — 526 нм и 636 нм), а длявизуализации ДНК, окрашенной DAPI, – фильтр 02 (максимум возбуждения —365 нм; максимум испускания — 420 нм).Фиксацию клеток и окраску ДНК для последующего анализа методомпроточной цитометрии (ПЦМ) проводили согласно опубликованной методике(Haase, Reed, 2002) с модификациями согласно Chang et al., 2015, однако вкачестве красителя использовали раствор SybrGreen I (1:105 в 50 мМ раствореTris pH 7,6).

Для разрушения комков клеток использовали соникатор BandelinSonopuls при мощности 40%; обработку проводили в два раунда по 45 секунднепосредственно перед анализом. Содержание ДНК определяли методом ПЦМна приборе BD FACSIII на базе ресурсного центра СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий».2.5. Методы работы с нуклеиновыми кислотами2.5.1. Выделение ДНКВыделение плазмидной ДНК из бактерий проводили с использованием набора реактивов GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas или Thermo Scientific)в соответствии с инструкцией производителя или методом щелочного лизиса(Zhou et al., 1990). Для очистки ПЦР-продуктов использовали набор реактивовGeneJET PCR purification kit (Thermo Scientific), а для выделения фрагментовДНК из геля — набор реактивов GeneJET Gel extraction Kit (Thermo Scientific).Выделение геномной ДНК из дрожжей для секвенирования проводили спомощью разрушения клеток стеклянными шариками и последующей очисткиДНК с помощью фенола и хлороформа (Lada et al., 2013).

Если ДНК плани-57ровали использовать для ПЦР, выделение проводили с помощью разрушенияклеток зимолиазой (ICN) по опубликованной методике (Kaiser et al., 1994) соследующими изменениями: для осаждения использовали этанол, а растворялиполученную ДНК в деионизованной воде. Выделение геномной ДНК для гибридизации с ДНК-микрочипом проводили согласно описанной методике (Zhang etal., 2013); полученные на промежуточном этапе блоки легкоплавкой агарозы слизатом дрожжевых клеток также использовали для электрофореза в пульсирующем поле.2.5.2. Выделение РНКВыделение РНК для гибридизации с ДНК-микрочипом производили с использованием набора реактивов RNeasy Mini Kit (Qiagen) согласно указаниямпроизводителя.Выделение РНК для обратной транскрипции с последующей количественной ПЦР в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) проводили с использованием набора реактивов GeneJET RNA Purification Kit (Thermo Scientific) согласноинструкции производителя из 108 клеток культуры, находящейся в логарифмический фазе роста (3–8×106 клеток/мл).Для очистки препаратов РНК от ДНК использовали инкубацию с ферментом DNase I (Thermo Scientific) с последующей очисткой РНК с помощью хлороформа и осаждением в смеси 0,3 М ацетата натрия pH 5,2 и 70% этанолаили набора реактивов RapidOut DNA Removal Kit (Thermo Scientific) согласноинструкции производителя.2.5.3.

Плазмиды, конструирование и проверка плазмидПлазмиды, использованные в данной работе, приведены в табл. 2.2.Таблица 2.2 — Плазмиды, использованные в работе.НазваниеКраткаяИспользованиеИсточник∗характеристикаpRT812µ,URA3,PCYC8, CYC8ampR, Сверхэкспрессия CYC8Trumbly, 198858Таблица 2.2 — Плазмиды, использованные в работе.НазваниеКраткаяИспользованиеИсточник∗характеристикаpRS426-MOT32µ,URA3,ampR, Сверхэкспрессия MOT3Получена Т.

М. РогозойampR, СверхэкспрессияDu et al., 2008PMOT3, MOT3p426GPDSWI1YFP 2µ,URA3,PTDH3, SWI1-YFPконструи-SWI1-YFP,рование плазмидp426GPD-QCYFP2µ,URA3,ampR, СверхэкспрессияPTDH3, SWI1QC-YFP SWI1QC-YFPp426GPD-YFP2µ,URA3,ampR, Контроль (сверхэкспрес- Получена П. В. Липаесия YFP)PTDH3, YFPYEplac181-URE22µ,LEU2,Du et al., 2010†войampR, Сверхэкспрессия URE2ПолученаМ. Д. Тер-АванесяномPURE2, URE2pRS4262µ, URA3, ampR, –, –КонтрольChristianson et al., 1992pRS4252µ, LEU2, ampR, –, –КонтрольChristianson et al., 1992pRS426-SFP12µ,URA3,ampR, Сверхэкспрессия SFP1Rogoza et al., 2010PSFP1, SFP1pFA6-kanMX4–, kanR, ampR, PTEF, Получение ПЦР-продук- Wach et al., 1994та для делеции геновkanRCRF1 и RPS9ApAG32–, hygB, ampR, PTEF, Получение ПЦР-продук- Goldstein,McCusker,та для делеции гена 1999hygBHSP104p426GPD-RPS9A2µ,URA3,ampR, Сверхэкспрессия RPS9A Данная работаPTDH3, RPS9ApRSU2CEN,URA3,ampR, Введение SUP35Волков, 2000PSUP3, SUP35pRS316CEN, URA3, ampRКонтроль, конструирова- Sikorski, Hieter, 1989ние плазмидpMT3193CEN,URA3,ampR, Введение SFP1Jorgensen et al., 2002URA3,ampR, Введение his7-1,6Данная работаSFP1pRS316-his7-1,6CEN,his7-1,6pGRS45-sup45-400 CEN,LEU2,sup45-400ampR, Введениеsup45-400, Аксенова и др., 2006конструированиеплаз-мидpRS315CEN, LEU2, ampR, –, Контроль–Sikorski, Hieter, 198959Таблица 2.2 — Плазмиды, использованные в работе.НазваниеКраткаяИспользованиеИсточник∗характеристикаpRS315-SUP45CEN,LEU2,ampR, Введение SUP45Le Goff et al., 2002PSUP45, SUP45pRS425-SUP452µ,LEU2,ampR, Сверхэкспрессия SUP45 ПолученаД.

А. Киктевым;PSUP45, SUP45опи-сана в: Matveenko et al.,2016pRS425-sup45-400 2µ,LEU2,ampR, СверхэкспрессияPSUP45, sup45-400YGPM5g092µ,LEU2,Данная работаsup45-400ampR, Сверхэкспрессия KTI11Jones et al., 2008chrII:85679–97752YGPM11j012µ,LEU2,ampR, Сверхэкспрессия KTI11Jones et al., 2008chrII:83900–93852YEplac181-TEF22µ,LEU2,ampR, Сверхэкспрессия TEF2Valouev et al., 2009ampR, СверхэкспрессияМурина и др., 2013PTEF2, TEF2pRS425-тРНКGln2µ,LEU2,tQ(UUG)LYGPM17c222µ,LEU2,tQ(UUG)LampR, СверхэкспрессияchrII:342627–353573YGPM18o192µ,LEU2,∗†tQ(UUG)BampR, СверхэкспрессияchrII:638044–648770Jones et al., 2008Jones et al., 2008tC(GCA)BДля каждой конструкции указаны следующие характеристики: копийность в дрожжевыхклетках (мультикопийная, 2µ, или центромерная, CEN); дрожжевой селективный маркер, бактериальный селективный маркер, промотор вносимого гена, вносимый ген. Прочерк означаетотсутствие соответствующего элемента.SWI1QC — участок SWI1 с 1011 по 3942 нуклеотид.Во всех конструкциях обозначение YFP использовано для EYFP, варианта последовательности с оптимизированным для экспрессии в клетках млекопитающих составом кодонов (см.Patterson et al., 2001).Плазмида pRS426-MOT3 получена клонированием фрагмента, ограниченного сайтами рестрикции XhoI и BamHI, из pCH2 (Hongay et al., 2002) вpRS426 по тем же сайтам (Т.

М. Рогоза, неопубликованные данные). Плазмида p426GPD-YFP получена обработкой p426GPDSWI1YFP эндонуклеазами рестрикции SpeI и SmaI с последующей обработкой фрагментом Клёнова для разрушения выступающих однонитевых фрагментов и лигированием(П. В. Липаева, неопубликованные данные). Плазмида pRS425-sup45-400 получена клонированием участка, ограниченного сайтами рестрикции PstI и NotI, из60pGRS45-sup45-400 в pRS425.