Диссертация (Анеуплоидия как механизм обратимого изменения супрессорного фенотипа (ISP) у дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 13

Для анализа данных проточной цитометриииспользовали программное обеспечение BD FACSDiva v8.0.1.2.7.4. Обработка данных экспрессии генов, полученных при гибридизации сДНК-микрочипомДля анализа данных экспрессии генов использовали метод построения линейной модели и сравнения значений с помощью модифицированного t-критерия с поправкой Бенджамини-Хохберга на множественные сравнения, реализованных в пакете limma (Smyth, 2005) для языка R (R Core Team, 2015). Необработанные данные депонированы в базе данных NCBI GEO (GSE52189).Пересечение и другие логические операции над списками генов выполнялис помощью R (R Core Team, 2015).

Полная последовательность использованныхопераций доступна на странице https://github.com/drozdovapb/microarray_yeast.Для получения обогащённости терминами GO использовали веб-интерфейсYeastmine (Balakrishnan et al., 2012); для сокращения списков терминов GO —веб-интерфейс Revigo (Supek et al., 2011).2.7.5. Работа с последовательностями нуклеиновых кислотДля подбора праймеров, планирования экспериментов по конструированию плазмид и анализа данных секвенирования по Сэнджеру использовали программы UGENE (Okonechnikov et al., 2012; Golosova et al., 2014), SnapGeneViewer (GSL Biotech LLC; http://www.snapgene.com/) и OligoAnalyzer 3.1 (IDT;https://eu.idtdna.com/calc/analyzer).

Для анализа промоторных областей использовали веб-сервис oPOSSUM3.0 (Kwon et al., 2012).Обработка данных секвенирования геномной ДНКНеобработанные(PRJNA296913,пользовалиныхSRP064279).FastQCконцовпрочтенияиv10.0депонированыДляанализа(Andrews,последовательностей2010);вархивекачествадляNCBIпрочтенийобрезкиSRAис-некачествен-адаптеров — fastx_toolkit(http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/) и cutadapt v1.11 (Martin, 2011).v0.0.13.167Сборку генома de novo осуществляли с помощью SPAdes (Bankevich etal., 2012) v3.1.0 с использованием IonHammer (опция iontorrent для исправления ошибок в участках гомополимеров).

Сборку контигов до псевдохромосомосуществляли с помощью chromosomer (Tamazian et al., 2016). Качество сборокоценивали с помощью программ CEGMA (Parra et al., 2007) и Quast (Gurevich etal., 2013). Для аннотации сборок использовали MAKER2 v2.31.8 (Holt, Yandell,2011).Для выравнивания коротких прочтений на геном использовали Bowtiev2.1.0 Langmead, Salzberg, 2012.

Для анализа покрытия генома использовалиqualimap v2.1 (Okonechnikov et al., 2015). В случае необходимости выравнивание визуализировали в программе UGENE (Okonechnikov et al., 2012; Golosovaet al., 2014). В качестве референса использовали геном штамма S288C версии R64-1-1, депонированный в базе данных дрожжевого генома Saccharomycesgenome database (Cherry et al., 2011). Определение однонуклеотидных различийосуществляли с помощью команды mpileup из пакета samtools (Li et al., 2009);позиции с качеством (q) менее 30 или покрытием менее 3 исключали из дальнейшего анализа с помощью vcftools (Danecek et al., 2011) v0.1.12b, после чегоиз анализа также исключали гетерозиготные позиции, определённые с помощьюстандартных команд bash, а с помощью bedtools (Quinlan, Hall, 2010) v2.17.0 также вариации в участках повторов, определённых с помощью RepeatMasker v4.0.5(http://www.repeatmasker.org/).

Для предсказания эффекта индивидуальных замениспользовали snpEff (Cingolani et al., 2012) v4.1. Для выявления замен, отличающих штамм 25-25-2В-П3982 от 15В-П4, использовали bedtools-intersect (Quinlan,Hall, 2010) с опцией -v. Распределение однонуклеотидных замен в геноме визуализировали с использованием пакета ggplot2 (Wickham, 2009) для среды программирования R (R Core Team, 2015).Полная последовательность команд, использованных для анализа данных секвенирования геномной ДНК, доступна на страницах https://github.com/drozdovapb/code_chunks/tree/master/Peterhof_strains_seq и https://github.com/drozdovapb/myBedGtfGffVcfTools.68Глава 3.

РезультатыПрирода — сфинкс. И тем она вернейСвоим искусом губит человека,Что, может статься, никакой от векаЗагадки нет и не было у ней.Ф. И. Тютчев3.1. Общая характеристика особенностей фенотипа и генотипа штамма25-25-2В-П3982Целью представленной работы являлось дальнейшее исследование механизмов, лежащих в основе обратимого изменения эффективности нонсенссупрессии. Это явление было изучено ранее в нескольких родственных штаммахПГЛ. Было показано, что в его основе этого, вероятно, лежит прионизация транскрипционного фактора Sfp1. Штаммы, содержащие такой прион, имеют фенотип Isp+ , а при элиминации приона происходит восстановление фенотипа Isp– .Вместе с тем, связь прионизации Sfp1 c изменением эффективности нонсенссупрессии оставалась неизвестной (см.

раздел 1.4.5). Для дальнейшего изученияприроды обратимой инверсии фенотипа штаммов, несущих мутацию sup35-25,были использованы изоляты Isp+ и Isp– штамма 25-25-2В-П3982. Эти изолятыявляются митотическими потомками штаммов, использованных ранее, но поскольку фенотип Isp– нестабилен, за прошедшее время они неоднократно былиподвергнуты процедуре повторного получения клонов Isp– в потомстве клоновIsp+ . Происхождение изолятов штамма 25-25-2В-П3982, использованных в работе, показано на рис. 3.1. Для удобства всем изолятам фенотипа Isp+ присвоеныназвания, начинающиеся с буквы p, а изолятам Isp– — названия, начинающиесяс буквы m.69p1p2m4p4↑↑ SWI1GuHCl GuHClm6p3↑↑ SFP1p11p10m1p14m2GuHCl m7m8m9p13p12m11Рисунок 3.1 — Схема, иллюстрирующая происхождение исследованных изолятов Голубойцвет фона соответствует изолятам фенотипа Isp– , фиолетовый – фенотипа Isp+ .В геноме штамма 25-25-2В-П3982 есть нонсенс-мутации ade1-14, his7-1,lys2-87, а также мутация sup35-25 с супрессорным проявлением (см.

1.4.5). Благодаря этой мутации все клоны этого штамма растут на среде без аденина; клоны фенотипа Isp– , но не фенотипа Isp+ , растут также на средах без лизина илигистидина (рис. 3.2).YEPDSMC+Isp (p3)Isp– (m2)SMC-AdeSMC-HisSMC-Lysp3m2Рисунок 3.2 — Клоны Isp+ (p3) и Isp– (m2) отличаются по интенсивности роста в отсутствиелизина или гистидина, но не различаются по интенсивности роста в отсутствие аденина.Здесь и далее показаны серии пятикратных разведений на 6-й день инкубации при температуре26 °C, а в скобках указаны номера изолятов.Кроме того, клоны Isp– отличаются немного сниженной скоростью роста(Volkov et al., 2002), большей термочувствительностью и меньшей эффективностью роста при использовании глицерина в качестве источника углерода (Волков, 2000; рис.

3.3).YEPD, 26 °CYEPD, 37 °CСПГIsp+ (p3)Isp– (m2)Рисунок 3.3 — Клоны Isp+ (p3) и Isp– (m2) отличаются по термочувствительности и дыхательной компетентности.70Прежде чем приступить к решению непосредственных задач работы, мырешили охарактеризовать генотип объекта нашего исследования. Для этого использовали данные полногеномного секвенирования, а именно прочтения, полученные при секвенировании геномных библиотек на основе ДНК одного изолятаIsp+ (p3) и одного изолята Isp– (m2) на приборе IonTorrent PGM. Кроме того, ванализ также взяли прочтения, полученные при секвенировании геномной ДНКштамма 15В-П4, одного из ближайших к прародителю ПГЛ гаплоидных штаммов.

Эти данные позволили нам разделять особенности, свойственные именно25-25-2В-П3982 или общие для штаммов ПГЛ.3.1.1. Проверка известных данных об особенностях генотипического фона25-25-2В-П3982Короткие прочтения, очищенные от последовательностей адаптеров, выравнивали на геном референсного штамма S288C, после чего на основе этихданных делали заключение о позициях, в которых в референсном и изучаемомгеноме находятся разные нуклеотиды, и о характере замены (её расположениивнутри генов или в межгенной области и вероятном влиянии на продукцию ипервичную структуру соответствующего белка).

Кроме того, оценивали области, отсутствующие в геноме изучаемого штамма. Все подозрительные позициидополнительно проверяли вручную по визуализации выравнивания (см. раздел2.7.5).Для проверки того, что использованный метод анализа генома можно применять для поиска замен, мы сравнили полученные данные с ранее известными. В геноме штамма 25-25-2В-П3982 были обнаружены все ранее описанныедля него мутации, а также установлена точная молекулярная природа некоторыхмутаций, для которых было ранее известно фенотипическое проявление (ауксотрофность) и способ получения или тип стоп-кодона, но не конкретное изменение ДНК (табл.

3.1). Таким образом, данные полногеномного секвенированиямогут быть использованы для поиска не известных ранее отличий изучаемогоштамма от референсного.71Таблица 3.1 — Данные полногеномного секвенирования согласуются с известнойинформацией о мутациях в геноме штамма 25-25-2В-П3982 и дополняют её.Обнаруженное изменениепоследовательности∗ade1-14G732A → TGA (Bertram et al., 2000) G732A → TGAA229T → TAA (Chabelskaya et al.,his7-1A229T → TAA2007)Мутация неизвестной природы,приводящая к ауксотрофности по†лейцину и аллельная leu2 (Л.

Н. Му- G748A → Asp250Asnleu2-B2рашко, неопубликованные данные;см. Инге-Вечтомов, 1971)Опал-мутация в гене LYS2 (см.G3465A → TGAlys2-87‡Chernoff et al., 1993)C1133T → Thr378Ile (Volkov et al.,sup35-25C1133T → Thr378Ile2002)G1199T → Gly400Val (Аксенова иsup45-400G1199T → Gly400Valдр., 2006)Опал-мутация (Инге-Вечтомов иthr4-B15A1180T →TGAдр., 1988)Делеция URA3, захватываДелеция URA3 (О. В.

Тарунина,§ющая 188 п. н. до и 93 п. н.ura3Δнеопубликованные данные)после ORFМутация∗†‡§Известные ранее данныеИспользованы стандартные однобуквенные обозначения нуклеотидов и трёхбуквенные обозначения аминокислот (IUPAC-IUB JCBN., 1984).Слева от стрелки приведено изменение нуклеотидной последовательности, справа — изменение в последовательности белка или возникающий стоп-кодон.

В случае, если аллелигенов в геномах штаммов S288C и 15В-П4 отличаются по последовательности, указаныизменения относительно последовательности соответствующего гена в штамме 15В-П4.Эту мутацию в разных работах называли leu2-1 (Волков и др., 1997), leu2-1A (Derkatch et al.,1996) и leu2-01 (Chernoff et al., 1993). Название leu2-1 не является легитимным, посколькубыло использовано ранее для обозначения независимо полученной нонсенс-мутации в томже гене (например, Hawthorne, Mortimer, 1968; Campbell et al., 1975). В данной работе использовано обозначение leu2-B2, которое соответствует принятым обозначениям ауксотрофностей в ПГЛ по номеру штамма, в котором впервые изолирована мутация (Инге-Вечтомов,1971).Также Л28.Также ду8.723.1.2. Анализ новых данных об особенностях генотипического фонаизучаемого штаммаМы более подробно изучили случаи возникновения преждевременногостоп-кодона в кодирующих последовательностях генома изучаемого штамма, поскольку их интерпретация более очевидна, чем в случае аминокислотных заменили мутаций в регуляторных областях.