Диссертация (Анеуплоидия как механизм обратимого изменения супрессорного фенотипа (ISP) у дрожжей saccharomyces cerevisiae)

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТНа правах рукописиДроздова Полина БорисовнаАНЕУПЛОИДИЯ КАК МЕХАНИЗМ ОБРАТИМОГОИЗМЕНЕНИЯ СУПРЕССОРНОГО ФЕНОТИПА (ISP) УДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAEСпециальность 03.02.07 — «Генетика»Диссертация на соискание учёной степеникандидата биологических наукНаучный руководитель:Доктор биологических наук, доцентГалина Анатольевна ЖуравлеваСанкт-Петербург — 20162ОглавлениеСтр.Введение . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7Глава 1. Обзор литературыФакторы, обеспечивающие эффективную терминациютрансляции у дрожжей Saccharomyces cerevisiae, и ихвзаимодействие . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101.1. S. cerevisiae как объект генетики . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . 101.2. Общие сведения о процессе трансляции у дрожжей S. cerevisiae . . 151.2.1. Состав рибосомы и регуляция синтеза компонентоврибосомы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161.2.2. Инициация трансляции . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211.2.3. Элонгация трансляции . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . 231.2.4. Терминация трансляции и рециклирование рибосом . . . . . 251.2.5. Деградация РНК с преждевременным стоп-кодоном . . . . . 261.3. Контроль эффективности терминации трансляции . . . . . . . . . . 281.3.1. Влияние последовательности и стабильности мРНК навероятность считывания стоп-кодона . . .

. . . . . . . . . . 281.3.2. Роль тРНК в считывании стоп-кодонов . . . . . . . . . . . . 291.3.3. Роль рРНК и рибосомных белков в считывании стоп-кодонов 311.3.4. Влияние изменений в белках, принимающих участие втерминации трансляции, на эффективность этого процесса . 321.3.5. Влияние белков, участвующих в других этапахтрансляции, на терминацию трансляции . . . . . . . . . . . . 341.3.6. Другие факторы, влияющие на считывание стоп-кодонов . .

341.4. Прионы дрожжей . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 361.4.1. Разнообразие и общие свойства прионов дрожжей . . . . . . 361.4.2. Связь [PSI + ] с терминацией трансляции . . . . . . . . . . . . 411.4.3. [NSI + ] и терминация трансляции . . . . . . . . . . . . . . . . 421.4.4. MOD5, [MOD+ ] и терминация трансляции . . . . . .

. . . . 4231.4.5. [ISP+ ] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 431.5. Заключение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49Глава 2. Материалы и методы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 512.1. Штаммы . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 512.2. Среды и методы культивирования . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 532.3. Методы генетики дрожжей . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 552.4. Методы микроскопии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 552.5. Методы работы с нуклеиновыми кислотами . .

. . . . . . . . . . . 562.5.1. Выделение ДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 562.5.2. Выделение РНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 572.5.3. Плазмиды, конструирование и проверка плазмид . . . . . . . 572.5.4. ПЦР, обратная транскрипция и гибридизация ДНК . . . . . 602.5.5. Электрофорез нуклеиновых кислот . . .

. . . . . . . . . . . 612.5.6. Получение делеций генов с помощью гомологичнойрекомбинации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 622.5.7. Секвенирование ДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 632.6. Методы работы с белками . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 632.6.1. Выделение белков . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. 632.6.2. Определение активности кислой фосфатазы . . . . . . . . . 642.7. Анализ данных . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 642.7.1. Статистические методы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 642.7.2. Анализ данных ОТ-ПЦР-РВ . . . . . . . . . . . . . . . . . . 652.7.3.

Анализ изображений . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 652.7.4. Обработка данных экспрессии генов, полученных пригибридизации с ДНК-микрочипом . . . . . . . . . . . . . . . 662.7.5. Работа с последовательностями нуклеиновых кислот . . . . 66Глава 3. Результаты . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . 683.1. Общая характеристика особенностей фенотипа и генотипаштамма 25-25-2В-П3982 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 683.1.1. Проверка известных данных об особенностяхгенотипического фона 25-25-2В-П3982 . . . . . . . . . . . . 7043.1.2. Анализ новых данных об особенностях генотипическогофона изучаемого штамма . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . 723.2. Влияние сверхпродукции Q/N-богатых регуляторовтранскрипции на изменение фенотипа клонов с Isp– на Isp+ . . . . . 763.2.1. Сверхпродукция Swi1p, но не другихаспарагин-глутамин-богатых регуляторов транскрипции,увеличивает частоту появления клонов Isp+ в потомствеклонов Isp– . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 773.2.2. Влияние сверхпродукции Swi1p на частоту появленияклонов Isp+ не связано с его агрегацией . . . . . . . . . . . . 793.2.3. Влияние сверхэкспрессии SWI1 на частоту появленияклонов Isp+ не связано с изменением уровня мРНК SFP1 . . 833.2.4. В потомстве трансформантов со сверхэкспрессией SWI1появляются автодиплоидные клоны .

. . . . . . . . . . . . . 843.3. Влияние Isp-статуса штамма и делеции гена SFP1 на экспрессиюбелок-кодирующих генов дрожжей . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 873.3.1. В клетках Isp+ , в отличие от клеток sfp1Δ, не сниженаэкспрессия мишеней Sfp1p . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . 893.3.2. В клетках Isp+ не изменена транскрипция большинствагенов биогенеза рибосом и генов рибосомных белков . . . . 903.3.3. Делеция гена CRF1 не влияет на проявление фенотипа Isp+923.3.4. Делеция и сверхэкспрессия гена RPS9A не влияют напроявление фенотипа Isp+ .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 943.3.5. Транскрипционные факторы, мишени которыхразличаются по уровню экспрессии в клонах Isp+ и Isp–. . 993.3.6. Функциональная классификация генов, экспрессиякоторых изменяется при делеции SFP1 или изменениифенотипа c Isp– на Isp+ .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1013.3.7. В клетках Isp+ активирована транскрипция генов белковклеточной стенки и генов, контролирующих импорт ионовжелеза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1013.3.8. В клонах Isp– усилена экспрессия генов хромосом II и IX . 1033.4. Сравнительный анализ геномов клонов Isp+ и Isp– . . .

. . . . . . . 10553.4.1. Секвенирование геномов подтверждает данные овариабельной копийности хромосом II и IX . . . . . . . . . . 1053.4.2. Анализ кариотипа независимо полученных клонов Isp+ и Isp– 1063.5. Поиск связи между геном SFP1 и фенотипом Isp+ . . . . . . . . . . 1103.6. Поиск связи между обработкой GuHCl и изменением кариотипа . . 1123.7. Анализ отдельных генов, изменение числа копий которых можетобъяснять различие фенотипов Isp+ и Isp– . . .

. . . . . . . . . . . . 1163.7.1. Введение дополнительной копии his7-1 улучшает ростклонов Isp+ на среде без гистидина . . . . . . . . . . . . . . 1183.7.2. Доза гена sup45-400 не определяет различие фенотиповIsp+ и Isp– . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1183.7.3. Cверхэкспрессия некоторых генов тРНК и гена TEF2увеличивает эффективность нонсенс-супрессии . . . . .

. . 122Глава 4. Обсуждение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1244.1. Фенотип Isp+ и его связь с уровнем экспрессии различных генов . 1244.2. Связь фенотипа Isp– и кариотипа клона . . . . . . . . . . . . . . . . 1264.3. Идентичность штаммов, использованных различнымиисследователями в ходе изучения фенотипа Isp+ . . . . . . . . . . . 1314.4. Влияние GuHCl на появление клонов Isp–в потомстве клонов Isp+ . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1324.5. Участие гена SFP1 в изменении фенотипа с Isp– на Isp+ . . . . . . . 1344.6. Участие гена SWI1 в переходе от фенотипа Isp– к фенотипу Isp+ . . 1384.7. Нестабильность кариотипа исследуемых штаммов . . . . . . . .

. . 1394.8. Заключение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141Глава 5. Выводы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142Список сокращений и условных обозначений . . . . . . . . . . . . . . . . 143Список литературы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . 144Благодарности . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179Приложение А. Праймеры, использованные в работе . . . . . . . . . . . 1806Приложение Б. Гены с преждевременными стоп-кодонами в геномештамма 25-25-2В-П3982 . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . 182Приложение В. ORF, экспрессия которых различается в клонах Isp+и Isp– . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185Приложение Г. Список биологических процессов (Go biologicalprocess), участвующими в которых генамиобогащены списки DEG в каждом из попарныхсравнений . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186Приложение Д. Результаты сравнительной геномной гибридизации(aCGH) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1887ВведениеАктуальность темы исследования. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae —модельный эукариотический объект, с помощью которого можно исследоватьмеханизмы многих процессов в клетке. Одним из таких процессов является терминация трансляции.