Диссертация (Анеуплоидия как механизм обратимого изменения супрессорного фенотипа (ISP) у дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 14

Мы обнаружили 46 ORF, которые в геноме изучаемого штамма, в отличие от генома штамма S288C, содержали преждевременный стоп-кодон, и 21 из этих ORF принадлежит подтверждённым генамс известной функцией (Приложение Б). В число этих ORF входят гены ADE1,HIS7, LYS2 и THR4 (см. табл. 3.1), а также другие гены, информация о вероятнойнефункциональности которых может быть полезна при интерпретации дальнейших результатов.Возможна и обратная ситуация: наличие преждевременного стоп-кодона вгеноме референсного штамма и отсутствие в геноме изучаемых штаммов. Мыобнаружили два таких гена, CRS5 и FLO8, в геномах 15В-П4 и 25-25-2В-П3982.В обоих случаях наличие стоп-кодона характерно только для S288C и близкородственных лабораторных штаммов (данные получены при множественном выравнивании последовательностей, содержащихся в Saccharomyces genome database).Ген CRS5 кодирует металлотионеин, сверхпродукция которого уменьшаетчувствительность штаммов с делецией CUP1 к избытку ионов меди в среде(Culotta et al., 1994).

CRS5 не гомологичен CUP1 и, в отличие от последнего, неамплифицируется при отборе штаммов, устойчивых к высокому уровню меди;кроме того, экспрессия CRS5 относительно слабо возрастает при добавлениимеди (Culotta et al., 1994), зато его продукт необходим в условиях избытка ионовцинка (Pagani et al., 2007). Возможно, основной функцией Crs5p является какраз участие в метаболизме ионов цинка.Ген FLO8 кодирует транскрипционный регулятор, необходимый для комкования клеток, псевдогифального роста диплоидных или инвазивного роста угаплоидных клеток (Kobayashi et al., 1996; Liu et al., 1996; Li et al., 2013).Ранее показано, что некоторые гибридные диплоидные штаммы, часть предковкоторых относилась к ПГЛ, содержат нормальную аллель FLO8 и способны кпсевдогифальному росту (Журавлева, Петрова, 2010; Petrova et al., 2015).

Кроме73того, связь с псевдогифальным ростом была показана для аллели гена AMN1,также кодирующего регулятор транскрипции (Li et al., 2013). S288C и родственные штаммы, в геномах которых закодирована укороченная аллель Flo8p и вариант Amn1p368Val , не способны к комкованию, а штаммы с полноразмерным Flo8pи Amn1p368Asp — способны (Liu et al., 1996; Li et al., 2013). Мы охарактеризовали этот фенотип у изучаемых штаммов и получили ожидаемые данные: клеткиштаммов ПГЛ образуют комки, в то время как клетки штамма S1, изогенногоS288C, комков почти не образуют (рис. 3.4).Amn1368Flo8142S115В-П425-25-2В-П3982ValStopAspTrpAspTrpРисунок 3.4 — Клетки штаммов ПГЛ образуют более крупные комки, чем клетки S1. Показаны микрофотографии жидких культур. Масштабная линейка соответствует 10 мкм.Следует отметить, что геном штамма 25-25-2В-П3982 отличается от генома штамма 15В-П4 намного сильнее, чем можно было бы предположить, зная,что первый штамм является потомком многочисленных скрещиваний штаммов,принадлежащих к ПГЛ и восходящих только к 15В-П4 или близкому к нему гаплоиду 6-П3: от 15В-П4 изучаемый штамм отличают приблизительно 16 тыс.замен, а от S288C — 34 тыс.

замен. Неравномерное распределение этих замен визучаемом геноме (рис. 3.5) позволяет предположить, что в родословной дипло-SNV на 1 т.п.н.ида П3982 присутствуют штаммы иного, нежели ПГЛ, происхождения.ХромосомаРисунок 3.5 — Распределение однонуклеотидных замен (SNV) в геноме штамма25-25-2В-П3982. Показано количество замен в окнах шириной 1 т. п.

н. Сиреневым цветом обозначены отличия от S288C, зелёным — от 15В-П4.74Кроме однонуклеотидных отличий, затрагивающих открытые рамки считывания, мы проанализировали и состав генома изучаемых штаммов. Известно,что в геномах многих штаммов S. cerevisiae, выделенных из природных илипромышленных изолятов независимо от штаммов, родственных S288C, найденыотсутствующие в референсном геноме гены (например, Wei et al., 2007; Stropeet al., 2015). Мы провели поиск генов, отсутствующих в геноме S288C, но описанных для других штаммов дрожжей, в геномах 15В-П4 и 25-25-2В-П3982 (см.раздел 2.7.5).

Гены, найденные хотя бы в одном из проанализированных геномов, указаны в таблице 3.2.В геномах обоих изучаемых штаммов были обнаружены гены KHR1 иRTM1. KHR1 кодирует киллерный токсин (Goto et al., 1990) и изучен довольнослабо. В сборке генома 25-25-2В-П3982 ген KHR1 был аннотирован на контиге, содержащем также несколько известных генов хромосомы IX, что совпадаетс данными Вэй и др.

(Wei et al., 2007), также локализовавшими этот ген нахромосоме IX в штамме YJM789. Ген RTM1, расположенный в прителомернойобласти, контролирует экспорт липидов и способствует выживанию штаммовв неблагоприятных условиях при некоторых технологических процессах (Ness,Aigle, 1995; Manente, Ghislain, 2009). В наших сборках этот ген был обнаружен в составе отдельного контига вместе со вторым геном так называемого кластера RTM1, что хорошо согласуется с данными литературы; покрытие этогоконтига приблизительно двукратно превышало медианное покрытие генома, чтосвидетельствует о вероятном наличии двух копий RTM1 в изучаемых геномахштаммов ПГЛ. Кластер RTM1 обычно ассоциирован с другим прителомернымкластером, SUC (Ness, Aigle, 1995). Семейство генов SUC у S. cerevisiae делитсяна две категории: SUC2, расположенный в левом плече хромосомы IX, и паралогичные гены, расположенные в прителомерных областях разных хромосом(Carlson, Botstein, 1983).

Анализ прочтений, схожих с геном SUC2, позволил намзаключить, что в геномах исследуемых штаммов ПГЛ содержится не менее двухгенов семейства SUC.Наконец, только в штамме 15В-П4 были обнаружены гены AMI1-A и геныиз так называемого «винного кластера» (табл. 3.2), ранее найденные в геномахнекоторых штаммов дрожжей (Borneman, Pretorius, 2015; Borneman et al., 2016).«Винный кластер» окружён повторяющимися последовательностями и являет-75ся очень пластичным элементом (Borneman et al., 2011), что может объяснятьего потерю в 25-25-2В-П3982 и других штаммах дрожжей, по происхождениюсвязанных с ПГЛ (Drozdova et al., 2016).Таблица 3.2 — Гены, отсутствующие в геноме S288C, но обнаруженные в геномахштаммов ПГЛ.Название гена Функция продуктаAMI1-AKHR1RTM1SCY_1426SUCWine12Wine23Wine34Wine45Wine56S288CАмидаза—Киллерный токсин —Экспортёр липидов —Предположительно —ТФ с «цинковымипальцами»ИнвертазатолькоSUC25-оксо-L-пролиназа —Пермеаза никоти- —новой кислотыФлоккулин—ТФ—ТФ—Штамм15В-П4++++25-25-2В-П3982—+*++≥ 2 генов ≥ 2 генов SUCSUCПсевдоген?** —+—+++———«—» — ген отсутствует, «+» — ген обнаружен.* — на том же контиге присутствуют известные гены хромосомы IX.** — содержит два сдвига рамки считывания.Таким образом, хотя первичный анализ генома штамма 25-25-2В-П3982 недаёт нам непосредственной информации для решения основного вопроса работы, он позволил создать массив данных, которые, как станет очевидно позже,оказались полезны для интерпретации полученных при работе с этим штаммомрезультатов, а также сделать предположение о его гибридном происхождении,несколько противоречащее известным ранее данным о том, что этот штамм является потомком от скрещивания только штаммов, принадлежащих к Петергофским генетическим линиям.763.2.

Влияние сверхпродукции Q/N-богатых регуляторов транскрипции наизменение фенотипа клонов с Isp– на Isp+Ранее были проведены скрининги библиотек генов, направленные на выявление генов, участвующих в развитии фенотипа Isp+ , то есть необходимых длявозникновения, поддержания или фенотипического проявления прионоподобного детерминанта [ISP+ ] (см. Обзор литературы).

В частности, в этих экспериментах были обнаружены SFP1 и некоторые другие гены (Рогоза и др., 2009;Гогинашвили и др., 2009; Rogoza et al., 2010). Тем не менее, некоторые геныв этих скринингах могли быть пропущены. Например, использованный методсверхэкспрессии генов был связан с индукцией GAL-промотора и использованием банка генов на основе кДНК (Гогинашвили и др., 2009), потому не позволялизучить гены, экспрессия которых ингибирована при отсутствии глюкозы, а также снижал вероятность изучить гены, мРНК которых присутствует в клетке внебольшом числе копий или которые сильно снижают жизнеспособность клетокпри сверхэкспрессии.

Так, например, ген SFP1 был выявлен при поиске генов,инактивация которых приводит к исчезновению детерминанта [ISP+ ] (Рогоза идр., 2009), однако он не был выявлен при скрининге с помощью экспрессионной библиотеки генов (Гогинашвили и др., 2009), несмотря на то, что впоследствии было выявлено влияние сверхэкспрессии SFP1, находящегося под контролем GAL-промотора, на частоту возникновения [ISP+ ] (Rogoza et al., 2010).В то же время, поиск с помощью инактивации генов инсерцией транспозона не позволяет выявить жизненно важные гены. Наконец, идентификация SFP1в качестве структурного гена [ISP+ ] не исключает того, что в поддержании этогодетерминанта могут участвовать и другие гены.В связи с этими результатами мы провели дополнительную выборочнуюпроверку влияния генов, кодирующих известные прионогенные белки-регуляторы транскрипции: Cyc8, Mot3, Swi1 и Ure2. Для сверхэкспрессии предпочтительно применяли конструкции, уже использованные в других работах для изучения этих белков.

В случае SWI1 ген находился под контролем GPD-промотораи был слит с последовательностью, кодирующей флуоресцентный белок YFP;во всех остальных случаях были использованы мультикопийные плазмиды с со-77ответствующими генами под контролем их собственных промоторов (см.