Диссертация (Анеуплоидия как механизм обратимого изменения супрессорного фенотипа (ISP) у дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 12

Плазмида p426GPD-RPS9A получена клонированием ПЦР-продукта RPS9A, полученного на матрице геномной ДНК с помощьюпраймеров RPS9A-F-XmaJI и RPS9A-R-XhoI и обработанного эндонуклеазамирестрикции XmaJI и XhoI, в вектор pRS426, обработанный эндонуклеазами рестрикции BcuI и XhoI. Плазмида pRS316-his7-1,6 получена клонированием ПЦРпродукта (использованы праймеры HIS7_F_HindIII_ и HIS7_R_HindIII_), обработанного эндонуклеазой рестрикции HindIII, в вектор pRS316, вскрытый темже ферментом. В обоих случаях в качестве источника геномной ДНК использовали штамм 25-25-2В-П3982.Рестрикцию проводили с использованием ферментов производства ThermoScientific в концентрации 1 единица активности на 10 мкл реакционной смеси и рекомендованных производителем буферных растворов.

Для лигированияиспользовали лигазу фага T4 (Thermo Scientific) согласно указаниям производителя. После трансформации бактерий лигазной смесью колонии, содержащиеискомую плазмиду, отбирали с помощью электрофореза грубого лизата бактериальных клеток (Barnes, 1977) и/или ПЦР с колонии (http://blog.addgene.org/plasmids-101-colony-pcr). Затем плазмиды проверяли с помощью рестрикции иПЦР, а последовательность вставки в сконструированных в этой работе плазмидах дополнительно проверяли секвенированием. Секвенирование проводилисотрудники ресурсного центра СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточныхтехнологий».2.5.4.

ПЦР, обратная транскрипция и гибридизация ДНКДля полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали полимеразу Taq(Сибэнзим или Fermentas) в количестве 0,5 единиц активности на 10 мкл реакционной смеси, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (Синтол) в концентрациипо 2 мМ, 10x буферный раствор (Сибэнзим) и праймеры (Бигль) в количестве1,5 пМ на 10 мкл смеси. Если в качестве матрицы использовали геномную ДНК,использовали смесь полимераз Taq и hot start Taq (Сибэнзим). Праймеры, использованные в данной работе, приведены в приложении А. Оптимальную температуру отжига праймеров определяли экспериментально.61Синтез кДНК проводили с использованием обратной транскриптазыRevertAid (Thermo Scientific) согласно инструкции производителя.

Для последующей количественной ПЦР в режиме реального времени использовали либо2x реакционную смесь iQ SybrGreen Super Mix (Bio-Rad) (при изучении экспрессии гена RPS9B), либо 2,5х реакционную смесь с красителем EVA Green(Синтол) (во всех остальных случаях); праймеры в количестве по 8 пМ на 20мкл реакционной смеси; 0,5 мкл полученной на предыдущем этапе реакционной смеси с кДНК; оптически прозрачные пробирки (Bio-Rad) и амплификаторCFX96 (Bio-Rad; Ресурсный центр СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий»).Мечение РНК, гибридизацию полученной кДНК с ДНК-микрочипамиYeast gene expression microarray 8 x 15K (Agilent), а также компьютерную обработку изображений проводили сотрудники Института прикладных наук г. Тулуза(Institut National des Sciences Appliquées de Toulouse).Мечение ДНК с использованием нуклеотидов Cy3-UTP (для опытнойДНК) или Cy5-UTP (для контрольной ДНК), а также гибридизацию полученной меченой ДНК с ДНК-микрочипом проводили согласно опубликованной методике (Zhang et al., 2013).

В качестве контроля была использована геномнаяДНК штамма PSL2 (Lee et al., 2009), любезно предоставленная М. Доминска(университет Дьюка), или геномная ДНК изолята p1 (см. 3.1). Эти эксперименты проводили в лаборатории Томаса Питеса (Thomas D. Petes) в университетеДьюка (Duke University).2.5.5. Электрофорез нуклеиновых кислотЭлектрофорез плазмидной ДНК и ПЦР-продуктов в агарозном геле проводили согласно стандартным методикам (Sambrook et al., 1989) с использованием1x или 0,5x буфера TBE; после окончания электрофореза гель окрашивали в растворе бромистого этидия и фотографировали с помощью цифровой видеокамерыCanon PowerShot G12. Качество РНК контролировали с помощью электрофорезав агарозном геле (1,2% агароза в буфере TAE) по наличию полос, соответствующих 18S и 26S рРНК.

Электрофорез геномной ДНК дрожжей в пульсирующемполе проводили согласно опубликованной методике (Zhang et al., 2013). Экспе-62рименты, связанные с электрофорезом в пульсирующем поле, также проводилив лаборатории Томаса Питеса.2.5.6. Получение делеций генов с помощью гомологичной рекомбинацииДелеции генов получали с помощью ПЦР согласно опубликованной методике (Wach et al., 1994): на матрице плазмиды pFA6-kanMX4 или pAG32синтезировали гибридный ПЦР-продукт, который включал кассету kanMX4 илиhphMX4 и участки, фланкирующие изучаемый ген в геномной ДНК (по 50 п.н.).Эти кассеты включают промотор и терминатор гена TEF Ashbya gossipii, контролирующие экспрессию гена kanR или hph и обеспечивающие устойчивость кгенетицину (G418) или гигромицину Б соответственно. Полученным ПЦР-продуктом трансформировали дрожжевые клетки. Для проверки корректности интеграции кассеты из полученных клонов выделяли ДНК, которую использовалидля ПЦР.

При получении делеции HSP104 проверку осуществляли с помощьюПЦР с фланкирующими область замены праймерами Hsp104_F1 и Hsp104_R1(праймеры 1 + 4 на рис. 2.1), поскольку длина гена HSP104 (около 2,7 т. п. н.)значительно превышает длину кассеты hphMX4 (около 1,5 т. п. н.). При получении делеции RPS9A или CRF1 ПЦР проводили, используя в качестве прямого праймера праймер, комплементарный последовательности ORF исследуемогогена (праймер 2 на рис. 2.1) или последовательности ORF гена устойчивостик антибиотику (праймер 3 на рис. 2.1); в случае корректной замены последовательности ожидали наличия ПЦР-продукта при использовании праймеров 3+4 иотсутствия продукта при использовании праймеров 2+4, а в случае наличия генадикого типа — обратной ситуации.

Последовательности праймеров приведены вприл. А.63Праймер 3Праймер 1kanMX4 или hphMX4ПЦР-продуктПраймер 2Изучаемый генГеномная ДНК дрожжейПраймер 4Рисунок 2.1 — Схема получения делеций генов с помощью трансформации ПЦР-продуктом.На схемах приблизительно указаны области посадки праймеров, использованных для проверкикорректности встраивания кассеты.2.5.7.

Секвенирование ДНКСеквенирование ПЦР-продуктов и плазмид с использованием капиллярного секвенатора ABI Prism 310, а также создание библиотек и секвенированиегеномной ДНК с использованием секвенатора на основе полупроводниковогомикрочипа Ion Torrent PGM проводили сотрудники Ресурсного центра СПбГУ«Развитие молекулярных и клеточных технологий».2.6. Методы работы с белками2.6.1. Выделение белковВыделение белков из клеток дрожжей проводили по методике Zhang etal., 2011 из жидких культур в логарифмической фазе роста (около 5×106 клеток/мл). Электрофорез денатурированных белков в содержащем додецил-сульфат натрия полиакриламидном геле (SDS-PAGE) проводили в соответствии состандартной методикой (Sambrook et al., 1989); концентрирующий и разделяющий гели содержали 5% и 8% акриламида соответственно. После проведения электрофореза белки переносили на поливинилидендифторидную мембрануHybond-P (Amersham, Швеция) с использованием аппарата Transblot Semi-DryTransfer Cell (Bio-Rad).64Инкубацию мембран с первичными антителами SE-45-2, специфичными кSup45p (Kiktev et al., 2009), или SE4290, специфичными к Sup35p (Chabelskayaet al., 2004), проводили в буфере TTBS, содержащем 2% сухого молока.

Вкачестве вторичных антител были использованы антитела, входящие в наборECL Plus Western Blotting Reagent Pack (Amersham). Детекцию комплексовбелков с антителами производили с использованием набора реагентов ECLAdvance/Seleсt Western Blotting Detection Kit (Amersham / GE Healthcare) и прибора GeneGnome (SynGene). Выравненность концентраций белков оценивалис помощью окрашивания мембраны в растворе Кумасси согласно протоколуWelinder, Ekblad, 2011 со следующим изменением: вместо Coomassie R-350 использовали Coomassie R-250.2.6.2. Определение активности кислой фосфатазыДля определения активности конститутивной кислой фосфатазы использовали модифицированную методику на основе ранее опубликованных (Toh-E etal., 1973; Падкина и др., 1974): 500 мкл клеток из жидкой культуры в стационарной стадии роста собирали центрифугированием, ресуспендировали в воде,инкубировали при температуре 30 °C в течение 10 минут, после чего клетки собирали и растворяли в 500 мкл буфера (0,1 М уксусной кислоты, pH 4,0, 1 мг/млпаранитрофенилфосфата) и инкубировали при температуре 30 °C в течение 10минут.

Реакцию останавливали добавлением 500 мкл 1 М NaOH, после чегоклеточную массу осаждали, надосадочную фракцию использовали для определения OD410 , а осадок ресуспендировали в воде и определяли OD600 . ОтношениеOD415 /OD600 использовали для оценки активности кислой фосфатазы.2.7. Анализ данных2.7.1. Статистические методыДля обработки счётных данных использовали точный тест Фишера (см.Dytham, 2011), а для более подробного анализа влияния факторной переменной65строили обобщённую регрессионную модель с последующим сравнением методом Тьюки (см. Hothorn et al., 2008b).

Для сравнения двух независимых выборокс непрерывной функцией распределения использовали критерий Манна-Уитни;для сравнения более двух независимых выборок применяли критерий КраскелаУоллиса (см. Dytham, 2011). Все расчёты проводили с использованием языкапрограммирования R, пакетов base, stats (R Core Team, 2015), multicomp (Hothornet al., 2008b) и coin (Hothorn et al., 2008a).2.7.2. Анализ данных ОТ-ПЦР-РВОбработку данных ОТ-ПЦР-РВ проводили следующим образом: для каждой технической повторности вручную проверяли характер кривой амплификации и кривой плавления (наличие одного чёткого пика), а для серии техническихповторностей — близость значения критического цикла (Cq ).

При соблюденииэтих условий технические повторности усредняли и определяли разницу междуCq для референсного гена и изучаемого гена (ΔCq). Статистическую значимостьразличий определяли с помощью критерия Манна-Уитни, если сравнивали двевыборки, и с помощью критерия Краскела-Уоллиса, если сравнивали большеечисло выборок, с последующим попарным сравнением с помощью критерияМанна-Уитни и поправкой Холма на множественные сравнения (см. Bretz et al.,2011). Анализ проводили с помощью функций, реализованных в пакетах base (RCore Team, 2015) и coin (Hothorn et al., 2008a) для языка программирования R(R Core Team, 2015).2.7.3.

Анализ изображенийПосле гибридизации ДНК-микрочип сканировали и анализировали с использованием программного обеспечения GenePix Pro 6.0; анализ участков ДНКс изменённой копийностью проводили с помощью алгоритма CLAC, реализованного в виде плагина для Microsoft Excel (Wang et al., 2005). Для количественногоанализа данных вестерн-блот-гибридизации использовали ImageJ (Schindelin etal., 2015); после получения количественных значений анализ проводили с ис-66пользованием R (см. раздел 2.7.1).