Диссертация (Анеуплоидия как механизм обратимого изменения супрессорного фенотипа (ISP) у дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 7

Это происходит за счёт непосредственного взаимодействия Rli1p и Sup45p(Khoshnevis et al., 2010).33eRF1 (Sup45p)1 MDNEVEKNIEIWKVKKLVQSLEKARGNGTSMISLVIPPKGQIPLYQKMLT51 DEYGTASNIKSRVNRLSVLSAITSTQQKLKLYNTLPKNGLVLYCGDIITE101 DGKEKKVTFDIEPYKPINTSLYLCDNKFHTEVLSELLQADDKFGFIVMDG151 QGTLFGSVSGNTRTVLHKFTVDLPKKHGRGGQSALRFARLREEKRHNYVReRF1-N201 KVAEVAVQNFITNDKVNVKGLILAGSADFKTDLAKSELFDPRLACKVISI251 VDVSYGGENGFNQAIELSAEALANVKYVQEKKLLEAYFDEISQDTGKFCY301 GIDDTLKALDLGAVEKLIVFENLETIRYTFKDAEDNEVIKFAEPEAKDKS351 FAIDKATGQEMDVVSEEPLIEWLAANYKNFGATLEFITDKSSEGAQFVTGминидоменeRF1-CeRF3-CeRF1-M401 FGGIGAMLRYKVNFEQLVDESEDEYYDEDEGSDYDFI1 MSDSNQGNNQQNYQQYSQNGNQQQGNNRYQGYQAYNAQAQPAGGYYQNYQ51 GYSGYQQGGYQQYNPDAGYQQQYNPQGGYQQYNPQGGYQQQFNPQGGRGN101 YKNFNYNNNLQGYQAGFQPQSQGMSLNDFQKQQKQAAPKPKKTLKLVSSS151 GIKLANATKKVGTKPAESDKKEEEKSAETKEPTKEPTKVEEPVKKEEKPVeRF3-2201 QTEEKTEEKSELPKVEDLKISESTHNTNNANVTSADALIKEQEEEVDDEV251 VNDMFGGKDHVSLIFMGHVDAGKSTMGGNLLYLTGSVDKRTIEKYEREAK301 DAGRQGWYLSWVMDTNKEERNDGKTIEVGKAYFETEKRRYTILDAPGHKM351 YVSEMIGGASQADVGVLVISARKGEYETGFERGGQTREHALLAKTQGVNKeRF3-1401 MVVVVNKMDDPTVNWSKERYDQCVSNVSNFLRAIGYNIKTDVVFMPVSGY451 SGANLKDHVDPKECPWYTGPTLLEYLDTMNHVDRHINAPFMLPIAAKMKD501 LGTIVEGKIESGHIKKGQSTLLMPNKTAVEIQNIYNETENEVDMAMCGEQeRF3 (Sup35p)551 VKLRIKGVEEEDISPGFVLTSPKNPIKSVTKFVAQIAIVELKSIIAAGFS601 CVMHVHTAIEEVHIVKLLHKLEKGTNRKSKKPPAFAKKGMKVIAVLETEA651 PVCVETYQDYPQLGRFTLRDQGTTIAIGKIVKIAEРисунок 1.9 — Структура комплекса факторов терминации трансляции человека (слева)и известные замены в соответствующих белках S.

cerevisiae (справа). Структура комплексаeRF1/eRF3 человека по данным электронной микроскопии приведена по Taylor et al., 2012. Цветшрифта соответствует цвету структуры домена (домены N и M Sup35p не гомологичны доменам1 и 2 eRF3 человека). Границы доменов Sup35p приведены по Kushnirov et al., 1988, границыдоменов Sup45p — по Saito, Ito, 2015. Указаны только одиночные замены или вторичные заменыс антисупрессорным эффектом. Зеленые круги в последовательности Sup45 обозначают искусственно полученные замены, не влияющие на эффективность нонсенс-супрессии, в последовательности Sup35p — естественные аминокислотные различия между штаммами ПГЛ и S288C.Позиции мутаций и их влияние на эффективность терминации трансляции указаны по даннымBreining, Piepersberg, 1986; Bertram et al., 2000; Bradley et al., 2003; Moskalenko et al., 2003;Москаленко и др., 2004; Chabelskaya et al., 2004; Аксенова и др., 2006; Akhmaloka, Subandi,2008; Hatin et al., 2009; Tuite et al., 1990; Merritt et al., 2010; Wada, Ito, 2014.341.3.5.

Влияние белков, участвующих в других этапах трансляции, натерминацию трансляцииНа эффективность терминации трансляции могут влиять белки, контролирующие другие стадии этого процесса. В частности, показано участие в нёмразличных субъединиц фактора инициации трансляции eIF3: замены в субъединицах eIF3 снижают эффективность нонсенс-супрессии, а делеция HCR1, иногданазываемого фактором eIF3j, — повышает (Beznoskova et al., 2013). Вероятно,этот эффект вызван связью терминации и следующего цикла инициации трансляции на той же матрице.Из двух генов, продукты которых выполняют роль фактора элонгацииeEF1α, лучше изучено влияние на трансляцию гена TEF2.

Мутации в этом генеприводят к нонсенс-супрессии (Sandbaken, Culbertson, 1988; Carr-Schmid et al.,1999), делеция обладает антисупрессорным проявлением (Song et al., 1989), асверхэкспрессия TEF2 — аллосупрессорным проявлением (Valouev et al., 2009;Матвеенко и др., 2013). Кроме того, показано, что делеция гена PPZ1, продукткоторого ингибирует активность EF1α, усиливает нонсенс-супрессию, а сверхэкспрессия — снижает (De Nadal et al., 2001); делеция и сверхэкспрессия SIS2,продукт которого ингибирует активность Ppz1p, обладают противоположнымэффектом (Aksenova et al., 2007; см. ниже).

Сверхпродукция субъединиц фактора элонгации eEF1B снижает эффективность нонсенс-супрессии; этот результатможно объяснить, если предположить, что eEF1B может обменивать гуаниловыенуклеотиды не только у eEF1A, но и у eRF3, приводя таким образом к активации eRF3 и увеличению эффективности терминации трансляции (Valouev et al.,2009). Кроме того, антисупрессорным эффектом обладает сверхпродукция белка Pab1 (Cosson et al., 2002); этот результат может объясняться либо влияниемPab1p на стабильность РНК, либо его взаимодействием с факторами терминации(см.

Nizhnikov et al., 2014).1.3.6. Другие факторы, влияющие на считывание стоп-кодоновВлияние на эффективность терминации трансляции показано также дляряда генов, основная функция продуктов которых с трансляцией не связана.В частности, эффективность нонсенс-супрессии увеличивают некоторые мута-35ции в гене ACT1, кодирующем актин, сверхэкспрессия STU2, белка вакуолярноймембраны (см. Nizhnikov et al., 2014), сверхэкспрессия нескольких Q/N-богатыхрегуляторов транскрипции (Нижников и др., 2011), делеция некоторых генов,связь которых с трансляцией неочевидна (Samanfar et al., 2014) и др.Увеличение дозы многих генов изменяет эффективность нонсенс-супрессии. Такое изменение может происходить не только при направленной сверхэкспрессии генов в контролируемых экспериментальных условиях (см.

выше), нои при случайном отборе сегментных дупликаций или полных дупликаций хромосом. Следует отметить, что S. cerevisiae отличаются высокой толерантностьюк анеуплоидии: например, жизнеспособны все варианты гаплоидных штаммов содной лишней хромосомой, кроме штаммов с дополнительной хромосомой VI, имножество вариантов со сложными кариотипами (Campbell et al., 1975; Espositoet al., 1982; Torres et al., 2007). Предполагают, что такая пластичность кариотипа связана с распределением относительного небольшого генома S. cerevisiaeпо относительно большому числу хромосом (Parry, Cox, 1970; см. Mulla et al.,2014).Показано, что изменение кариотипа может влиять на эффективность нонсенс-супрессии: дополнительная копия хромосомы VIII может снижать эффективность нонсенс-супрессии. При замене SUP35 на гомологичный ген из другого вида дрожжей, Pichia methanolica, были получены клоны, обладающие вразной степени выраженным нонсенс-супрессорным фенотипом.

Было высказано предположение, что это разнообразие связано со спонтанным образованием внекоторых из этих штаммов приона, схожего с [PSI + ] (см. ниже). Такой фенотип,сниженная эффективность нонсенс-супрессии, был обозначен Asp+ . Было показано, что стабильность фенотипа Asp+ в ряду клеточных поколений несколькоснижается при пассировании клонов на среде с гидрохлоридом гуанидина, веществом, блокирующим передачу дрожжевых прионов (см. ниже). Эти данныепоказывали сходство Asp+ с известными прионами S. cerevisiae (Inge-Vechtomovet al., 1998). При последующем более подробном изучении Asp+ предположениео прионной природе не было подтверждено, однако было показано, что снижение эффективности нонсенс-супрессии не вызвано повышением эффективноститерминации трансляции и ассоциировано с дупликацией хромосомы VIII, причём ключевую роль в определении фенотипа играет увеличение дозы гена SBP1,36расположенного на этой хромосоме.

Sbp1p принимает участие в контроле деградации мРНК и инициации трансляции. Возможно, снижение эффективностинонсенс-супрессии в этой системе связано с деградацией мРНК (Zadorsky et al.,2015).1.4. Прионы дрожжейКроме регуляции на стадии продукции, белки, участвующие в трансляции, могут подвергаться посттрансляционным модификациям.

К посттрансляционным модификациям можно отнести и образование амилоидных агрегатов,показанное для некоторых белков. Изменение конформации белка, приводящеек образованию наследуемых амилоидных агрегатов, называют прионизацией, атакие наследуемые детерминанты — прионами (см. Prusiner, 1982; Wickner et al.,1999).1.4.1. Разнообразие и общие свойства прионов дрожжейЧисло обнаруженных у дрожжей S. cerevisiae прионов значительно превышает таковое у любого другого живого организма. Это может быть связано как схорошей изученностью этого вида, так и с уникальными особенностями его биологии.

На сегодня у дрожжей известно и в разной степени изучено более десятиприонов и прионоподобных детерминантов. Некоторые примеры приведены втаблице 1.4.37Таблица 1.4 — Неполный список наиболее хорошо изученных прионов и прионоподобныхдетерминантов S. cerevisiae. По Crow, Li, 2011; Drozdova, Matveenko, 2015.НазваниеприонаСтруктурный белок и его функция Q/N-обогащённость / СсылкиОбразованиеамилоида/Зависимость от HSP104[URE3]Регулятор транскрипции Ure2Да / да / даLacroute,1971;Wickner,1994;Moriyama et al.,2000[PSI + ]Sup35p,фактортерминации Да / да / даCox,1965;трансляции eRF3 (см. разделWickner,1994;1.2.4)King, Diaz-Avalos,2004+[PIN ]Rnq1p, белок с неизвестной функ- Да / да / даSondheimer,+([RNQ ]) циейLindquist, 2000;Derkatch et al.,2001[ISP+ ]Sfp1, регулятор транскрипции ге- Да / неизвестно / нетVolkov etal.,нов RP и Ribi (см.

раздел 1.2.1)2002;Rogozaet al., 2010[SWI + ]Swi1, компонент комплекса ремо- Да / да / даDu et al., 2008делирования хроматина SWI/SNF[OCT + ]Cyc8 (Ssn6), участник комплек- Да / нет / даPatel et al., 2009са репрессоров транскрипцииCyc8/Tup1[GAR+ ]Pma1 (?), мембранная АТФаза, и Нет / нет / нетBrown, Lindquist,Std1 (?), регулятор ответа клетки2009на наличие глюкозы+[NUP100 ] Nup100, компонент комплекса Да / да / даHalfmann et al.,ядерной поры2012b[NSI + ]Swi1 + Rnq1Да / да / даSaifitdinova et al.,2010;Галкин,2015+[MOT3 ]Mot3Да / да / даAlberti et al., 2009+[MOD ]Mod5, фермент, переносящий ди- Нет / да / даSuzuki et al., 2012метилаллилпирофосфат на тРНКПервые прионные детерминанты дрожжей, [PSI + ] и [URE3], были описаны как мутации, которые не удавалось картировать ни в хромосомной ДНК, ни38в таких цитоплазматических молекулах ДНК, как митохондриальная или вирусная ДНК (Cox, 1965; Lacroute, 1971).