Диссертация (Анеуплоидия как механизм обратимого изменения супрессорного фенотипа (ISP) у дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 6

Взаимодействие Upf2p с Upf1p приводит к изменению пространственнойструктуры последнего и расплетению РНК с последующим удалением кэпа идеградацией экзонуклеазой Xrn1p (рис. 1.7; см. Roy, Jacobson, 2013).Существует несколько моделей того, каким образом система NMD определяет, необходимо ли подвергнуть конкретную молекулу мРНК деградации,т. е.

отличает естественные стоп-кодоны от преждевременных. Во-первых, ещёдо выхода в цитоплазму c мРНК связывается ряд белков (в частности, геликаза Hrp1p). В случае нормальной трансляции Hrp1p механически отделяется отмРНК при протягивании последней через рибосому. Если же мРНК содержитпреждевременный стоп-кодон, связанный с последовательностью после стопкодона белок Hrp1p остаётся на мРНК, и его узнают белки системы NMD.27Во-вторых, существуют данные о том, что подверженность мРНК деградацииопределяется длиной 3’-некодирующей области (модель faux 3’-UTR, «ложной»3’-некодирующей области). В то время как расстояние между естественнымстоп-кодоном и поли(А)-хвостом у нормальных мРНК невелико, и может происходить взаимодействие поли(А)-связывающего белка Pab1p с eRF3 (см.

рис.1.4), у мРНК с преждевременным стоп-кодоном такое расстояние значительнобольше, что препятствует взаимодействию eRF3 и Pab1p (рис. 1.7). Эти моделине являются взаимоисключающими (см. Roy, Jacobson, 2013)Hrp1DSETReIF4-Um7GUpf3Upf2Upf1eRF3eRF13'StopuxfaAAAAAAAAAAAPab1StopФосфорилирование Upf1eRF3Hrp1DSEXrn1AAAAAAAAAAAPab1eIF4eRF1StopStopUpf1Upf2Upf3Рисунок 1.7 — Упрощённая схема деградации мРНК, опосредованной преждевременнымстоп-кодоном.

m7G — кэп; faux 3’-UTR — ложная 3’-некодирующая область, DSE — элемент последовательности после стоп-кодона. По Roy, Jacobson, 2013.281.3. Контроль эффективности терминации трансляцииТочность трансляции составляет порядка 10-4 . Эта величина контролируется на многих уровнях (см. Yadavalli, Ibba, 2012).

С. Г. Инге-Вечтомов предположил, что поливариантность трансляции (возможность образования несколькихпродуктов на основе одной и той же нуклеотидной последовательности) можнорассматривать как адаптивный признак, позволяющий организму существоватьв более широком диапазоне условий среды (Инге-Вечтомов, 1969).Синтез разных белков на матрице одной и той же последовательностимРНК может происходить в силу нескольких событий, в том числе включениянеправильной аминокислоты, сдвига рамки считывания, терминации трансляциипри отсутствии стоп-кодона или отсутствия терминации трансляции при достижении стоп-кодона.

Наиболее хорошо изучен последний тип «ошибок» трансляции — считывание стоп-кодонов как значащих, или нонсенс-супрессия. На этотпроцесс влияет множество факторов, многие из которых были обнаружены приизучении нонсенс-супрессорных мутаций (см. Nizhnikov et al., 2014).1.3.1. Влияние последовательности и стабильности мРНК на вероятностьсчитывания стоп-кодонаНа эффективность терминации трансляции влияет как сама терминирующая последовательность (стоп-кодон), так и окружающие её нуклеотиды. Вопервых, три стоп-кодона различаются по эффективности терминации трансляции: кодон UAA обеспечивает терминацию с наибольшей вероятностью, в случае UAG эта вероятность ниже, а в случае UGA минимальна.

Кроме того, наэту величину влияет нуклеотид, непосредственно следующий за стоп-кодоном.Предполагают, что этот эффект вызван тем, что образование вторичных структурмРНК может изменять динамическое равновесие между eRF1 и естественнымисупрессорными тРНК (см. ниже), смещая его в сторону вторых. Схожий механизм (изменение структуры мРНК, приводящее к изменению пространственнойструктуры рибосомы) был предложен для объяснения влияния нуклеотидов пе-29ред стоп-кодоном на эффективность нонсенс-супрессии (см. Dabrowski et al.,2015).Наконец, на вероятность синтеза полноразмерного белка на матрице мРНК,содержащей преждевременный стоп-кодон, влияет стабильность этой мРНК.

Показано, что к нонсенс-супрессии приводит мутация в любом из трёх основныхгенов, кодирующих компоненты NMD (Ono et al., 1982; Ono et al., 2005), а такжепродукция схожего с Upf1p белка Mtt1 (Czaplinski et al., 2000). Для объясненияэтих данных предложены два механизма. Во-первых, компоненты NMD взаимодействуют с факторами терминации трансляции (Czaplinski et al., 1998; Wanget al., 2001). Во-вторых, ослабление деградации мРНК увеличивает вероятностьсинтеза с неё продукта и, соответственно, вероятность считывания стоп-кодона.Есть данные о деградации по пути NMD мРНК гена ALR1, продуктом которогоявляется транспортер ионов Mg2+ . Избыток этих ионов при инактивации NMDувеличивает вероятность считывания стоп-кодона.

Таким образом, свой вкладв наблюдаемое изменение нонсенс-супрессии при нарушении работы системыNMD могут вносить оба механизма (Roy, Jacobson, 2013).1.3.2. Роль тРНК в считывании стоп-кодоновКодон-специфические нонсенс-супрессорные мутации обычно оказываются мутациями в генах тРНК, приводящими к изменению антикодона. В геномеS. cerevisiae закодировано около 275 тРНК (Chan, Lowe, 2009), т.

е. большинство тРНК закодировано несколькими генами, поэтому изменение специфичности продукта одного из них может быть совместимо с жизнью клетки. Известны супрессорные мутации в различных генах тРНК, считывающие стоп-кодоныUAA (ochre) или UAG (amber). Интересно, что хотя мутации, узнающие стопкодон UGA (opal, или umber), также были описаны (Hawthorne, Leupold, 1974;Hawthorne, 1976; Ono et al., 1988), однако их соответствие определённым генамтРНК неизвестно (табл. 1.3).

Мутантную тРНКTrp , узнающую UGA, можно получить, однако для этого нужно внести изменения не только в антикодон, но и впоследовательность интрона (Atkin et al., 1990).30Таблица 1.3 — Примеры супрессорных тРНК.Тип супрессируемых Подставляемая амимутацийнокислотаochre (UAA)Yне менее 8 (Gilmore et al., 1971)LSне менее 6 (Ono et al., 1979b; 1981)не менее 4 (Ono et al., 1979a)не менее 8 (Piper, Wasserstein, 1976;Liebman et al., 1976)Yamber (UAG)Lне менее 8 (Liebman et al., 1977; 1984)1 с рецессивным летальным эффектом(Brandriss et al., 1976)Не менее 17 различных генов, но ни одинне картирован (Hawthorne, Leupold, 1974;Hawthorne, 1976; Ono et al., 1988)Sopal = umber (UGA)Число известных генов?Считывание стоп-кодонов могут производить не только мутантные молекулы тРНК, но и молекулы дикого типа, причём вероятность считывания стопкодонов на некотором фоновом уровне существует при отсутствии супрессорных мутаций.

Так, сверхэкспрессия генов тРНКGln может приводить к супрессииUAA или UAG (Pure et al., 1985; Lin et al., 1986), а в случае UAG слабое увеличение супрессии заметно даже при физиологическом уровне экспрессии (Weisset al., 1987). Следует отметить, что при анализе аминокислот, включаемых в белок при считывании кодонов UAA или UAG, были действительно обнаруженыглутамин, а также тирозин и лизин; в случае кодона UGA происходит включениев белковую цепь остатков триптофана, цистеина или аргинина (рис. 1.8).AAA (K)CAA (Q)GAA (E)UAU (Y)UAC (Y)AAG (K)CAG (Q)GAG (E)UCG (S)UUG (L)UAA (ochre)Q,Y,KUAG(amber)Q,Y,KUGG (W)UUA (S)UCA (S)UGA(opal)W,C,RAGA (R)CGA (R)GGA (G)UGC (C)UGU (C)Рисунок 1.8 — Кодоны, которые могут в норме узнавать естественные супрессорные тРНК, иаминокислоты, найденные в синтезированных в результате считывания стоп-кодона белках.

Поматериалам Blanchet et al., 2014 и Roy et al., 2015.31Наконец, на считывание стоп-кодонов могут влиять посттранскрипционные модификации тРНК, а следовательно, и активность ферментов,ответственных за эти модификации. Так, мутация в гене изопентенилтрансферазы MOD5 приводит к снижению эффективности нонсенс-супрессии (Laten et al., 1978), а потеря активности белка Sua5, необходимого дляN6-треонилкарбамоилирования остатков аденозина в тРНК — к появлению нонсенс-супрессии (Lin et al., 2010).1.3.3.

Роль рРНК и рибосомных белков в считывании стоп-кодоновИменно с рибосомами связано явление фенотипической супрессии — усиление считывания стоп-кодонов в присутствии некоторых антибиотиков, в частности, гигромицина Б (Singh et al., 1979) и паромомицина (Palmer et al., 1979).В рРНК известны замены, приводящие как к снижению, так и к увеличению эффективности терминации трансляции (см.

Nizhnikov et al., 2014). Вчастности, при замене в последовательности 18S рРНК дрожжей нуклеотидов,важность которых для точности трансляции показана у E. coli, можно получитькак повышающие, так и снижающие эффективность нонсенс-супрессии мутации(Chernoff et al., 1994; 1996; Velichutina et al., 2001). Мутации как с супрессорным, так и с антисупрессорным проявлением получены также в гене 5S рРНК(Smith et al., 2001).

В 25S рРНК известна замена с супрессорным проявлением(Liu, Liebman, 1996). Наконец, сверхэкспрессия гена SNR18, принимающего участие в модификации рРНК, снижает эффективность нонсенс-супрессии (Hatin etal., 2007).Кроме того, в генах RPS2 (SUP139) и RPS9B (SUP46), кодирующих белкималой субъединицы рибосомы, обнаружены омнипотентные (действующие поотношению ко всем стоп-кодонам) супрессорные мутации с доминантным проявлением (Ono et al., 1989; Ishiguro et al., 1981). Для разных замен в ещё одномбелке малой субъединицы, Rps28, было показано как увеличение, так и снижение эффективности нонсенс-супрессии (Alksne et al., 1993). Эти результатысогласуются с данными, полученными для E.

coli: Rps9p и Rps2p соответствуютбактериальным белкам S4 и S5, замены в которых приводят к нонсенс-супрес-32сии, а Rps28p — белку S12, замены в котором могут подавлять проявление заменв S4 или S5 (см. Ogle, Ramakrishnan, 2005).1.3.4. Влияние изменений в белках, принимающих участие в терминациитрансляции, на эффективность этого процессаВ генах SUP35 и SUP45 известно множество мутаций, приводящих, какправило, к омнипотентной нонсенс-супрессии с рецессивным проявлением (см.Inge-Vechtomov et al., 2003, рис. 1.9).

Следует отметить, что хотя оба гена являются жизненно важными, для каждого из них известны нонсенс-мутанты (Tuiteet al., 1990; Moskalenko et al., 2003; Bradley et al., 2003; Chabelskaya et al.,2004), выживание которых обеспечивается присутствием в клетке полноразмерного белка, синтезированного при считывании стоп-кодона, спровоцированногов том числе самой нонсенс-мутацией и в некоторых случаях дополнительнойсупрессорной мутацией в тРНК.

Следует также отметить, что в то время как вгене SUP35 известны только мутации с супрессорным проявлением, а все миссенс-мутации локализованы в части гена, кодирующей С-домен белка Sup35, вгене SUP45 известны мутации как с супрессорным, так и с антисупрессорнымпроявлением, причём они распределены почти по всей длине гена (рис. 1.9). Наконец, белок Sup35 за счёт N-концевого домена может переходить в прионноесостояние, что также приводит к супрессорному фенотипу, однако в этом случаес доминантным наследованием (см. ниже).Кроме собственно факторов терминации, в считывании стоп-кодонов принимает участие Rli1p: снижение уровня этого белка, достигнутое при его продукции под контролем репрессируемого промотора, приводит к сравнимому смутациями sup35 или sup45 уровню считывания стоп-кодонов, а сверхпродукция Rli1p в штамме с мутацией sup45 — к снижению уровня нонсенс-супрессии.