Диссертация (Анеуплоидия как механизм обратимого изменения супрессорного фенотипа (ISP) у дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 5

Наконец, для нормального уровня экспрессиинекоторых генов RP необходим белок Hmo1, который также участвует в упаковке хроматина и активации РНК-полимеразы I (Berger et al., 2007). Возможно,Hmo1p необходим для связывания Fhl1p с некоторыми промоторами (Kasaharaet al., 2007).Ещё одной особенностью многих генов RP (7 однокопийных и 94 дуплицированных) является наличие одного или двух интронов, причём удаление интронов может как усиливать, так и ослаблять экспрессию этих генов (Parenteauet al., 2011), что может по крайней мере частично объясняться участием интрона одного из генов в ингибировании сплайсинга мРНК гена-паралога (Plocik,Guthrie, 2012).Таким образом, экспрессия генов, необходимых для сборки рибосомы, подвергается сложной регуляции на уровне транскрипции, на которую влияют условия среды.

В этой регуляции принимают участие как репрессоры, так и активаторы транскрипции, а тонкая регуляция генов с высоким уровнем экспрессиидостигается дополнительной регуляцией на уровне сплайсинга.211.2.2. Инициация трансляцииИнициация — это этап трансляции, наиболее разнообразный в разных группах живых организмов и обеспечиваемый сборкой самого сложного нуклеопротеинового комплекса. У дрожжей в этом процессе, кроме субъединиц рибосомы,инициаторной метиониновой тРНК и мРНК, участвуют 11 белковых факторовинициации (см. Dever et al., 2016; табл. 1.1). На первом этапе малая субъединица рибосомы, связанная с факторами инициации eIF1, eIF1A и eIF3 вместе сфактором eIF5 и инициаторной тРНКMet , связанной с eIF2 в комплексе с ГТФ,объединяются в преинициаторный комплекс (рис. 1.4, I).

Этот комплекс взаимодействует с мРНК, связанной с фактором eIF4 и белком Pab1p (рис. 1.4, II), с образованием открытого комплекса (рис. 1.4, III). На следующем этапе происходитсканирование (поиск старт-кодона AUG) и образуется закрытый комплекс; приэтом происходит гидролиз молекулы ГТФ, связанной фактором eIF2 (рис. 1.4,IV). Наконец, к комплексу при участии eIF5B присоединяется большая субъединица рибосомы и высвобождаются все факторы, кроме eIF4 (рис. 1.4, V).

Такимобразом, в этот момент собранный на мРНК комплекс готов к началу трансляции, а связанный с ГДФ eIF2 регенерирует при участии комплекса eIF2B и можетсвязываться со следующей инициаторной тРНКMet (см. Dever et al., 2016).Таблица 1.1 — Факторы элонгации и терминации трансляции. По материалам Dever et al., 2016и Firczuk et al., 2013.ФакторГен(ы)Приблизительноеколичествофакторов на 1 рибосомуeIF1SUI1Нет данныхeIF1ATIF110,3eIF2SUI2, SUI3 и GCD110,1eIF2BGCN3, GCD7, GCD1, GCD2 и GCD60,03eIF3RPG1, PRT1, NIP1, TIF35, TIF34 и 0,1HCR1eIF4ATIF1/TIF21,2eIF4BTIF30,1eIF4ECDC330,4eIF4GTIF4631/TIF46320,1eIF5TIF50,1eIF5BFUN120,02223131A1мРНКPab1AAAAAAAA1A5m7G4E4G4AМалаясубъединица4BI. Преинициаторный комплекс5GAUII. Активированная мРНКГТФeIF2Pab1AAAAAAAAтРНКMet4E m7G2BтРНКMet4E m7G4G511A4A4B3GAUIII.

Открытый комплекс5СканированиемРНКPab1AAAAAAAAмРНКPab1AAAAAAAA4GAUG4A4E m7G4B5B::ГДФмРНК4GAUG 51A4A4B3IV. Закрытый комплекс11A35B::ГТФБольшаясубъединицаРисунок 1.4 — Упрощённая схема инициации трансляции. Номерами обозначены факторыинициации. По Dever et al., 2016.Контроль инициации на примере Gcn4pОбычно мРНК дрожжей содержат только одну открытую рамку считывания, и трансляция начинается с первого с 5’-конца кодона AUG, но есть незначительное количество исключений (см. Dever et al., 2016). Известный пример —кодирующий ТФ ген GCN4, в промоторной области которого расположены 4короткие ORF (uORF). При нормальном уровне аминокислот трансляция начи-23нается в соответствии с общим механизмом с первого метионинового кодона,который принадлежит uORF1; в случае приблизительно половины рибосом происходит реинициация и трансляция uORF2, uORF3 и uORF4; трансляция последовательности, начинающейся с собственного метионинового кодона GCN4,не происходит (см.

Hinnebusch, 2011). При недостатке аминокислот повышается концентрация не связанных с аминокислотами тРНК и за счёт этого происходит активация киназы Gcn2. Gcn2p фосфорилирует α-субъединицу фактораинициации eIF2, что приводит к ингибированию обмена ГДФ на ГТФ. Такимобразом, количество комплексов eIF2 с ГТФ и тРНКMet снижается, и в связи сих недостатком сканирующий комплекс может пропускать метиониновые кодоны uORF2, uORF3 и uORF4 и инициировать трансляцию со стартового кодонаGCN4 при связывании с eIF2, ГТФ и тРНКMet (см. Hinnebusch, 2005).1.2.3.

Элонгация трансляцииВ момент начала элонгации в P-сайте рибосомы располагается аа-тРНК,а A-сайт свободен. К нему подходит комплекс из аа-тРНК, и фактора eEF1A(eEF1α) с ГТФ. Если тРНК узнаёт кодон, находящийся в A-сайте, происходит гидролиз ГТФ, eEF1A и ГДФ высвобождаются, а аа-тРНК располагаетсяв A-сайте, после чего происходит образование пептидной связи, катализируемоепептидилтрансферазным центром рибосомы. Затем пространственная структурарибосомы изменяется таким образом, что акцепторный стебель пептидил-тРНКоказывается в гибридном положении P/E, а аа-тРНК — в гибридном положенииA/P; антикодоновые петли этих молекул остаются в P- и A-сайтах соответственно. В этот момент с комплексом связывается фактор eEF2B в комплексе с ГТФ;гидролиз ГТФ способствует сдвигу антикодоновых петель в E- и P-сайты.

Наконец, деацилированная тРНК высвобождается из E-сайта (для успешного прохождения этого процесса необходим фактор eEF3), и A-сайт готов к подходуследующего комплекса eEF1A, аа-тРНК и ГТФ. Для запуска следующей итерации необходим обмен ГДФ на ГТФ у eEF1A, катализируемый факторами eEF1Bαи eEF1Bγ (см. табл. 1.2; рис. 1.5; Kapp, Lorsch, 2004; Dever et al., 2016)24IVIE PAаминоацилтРНКEF1A::ГТФE PAeEF2::ГДФГДФТранслокациярибосомыeEF3EF1βEF1γeEF2::ГТФДеацилированнаятРНКIIIIIГТФГидролиз ГТФФормированиепептидной связиE PAE PAМалаяБольшая Субъединицы рибосомыРисунок 1.5 — Общая схема элонгации трансляции у S. cerevisiae. По материалам Dever,Green, 2012; Dever et al., 2016.Фактор элонгации трансляции eEF1A — один из самых высококопийныхбелков в клетке (Firczuk et al., 2013; табл. 1.2).

Мутации в TEF2 влияют наточность трансляции в целом (см. Dever et al., 2016) и на эффективность нонсенс-супрессии (см. ниже).Таблица 1.2 — Факторы элонгации и терминации трансляции. По материалам Dever et al., 2016и Firczuk et al., 2013.ФакторГен(ы)ПриблизительноеколичествофактороврибосомуeEF1A (EF1α)TEF1 и TEF25eEF1Bα (EF1β)EFB1 (TEF5)eEF1Bγ (EF1γ)TEF4 и CAM1eEF2EFT1 и EFT20,7eEF3YEF3 (TEF3) и HEF3 (?)0,6eIF5AHYP2 и ANB12eRF1SUP450,11eRF3SUP350,07Rli1 (ABCE1)RLI1Нет данных0,4на1251.2.4. Терминация трансляции и рециклирование рибосомКогда в A-сайт рибосомы входит один из трёх стоп-кодонов (UAA, UAGили UGA), вместо тРНК такой кодон узнаёт комплекс факторов терминациитрансляции eRF1 и eRF3, которые у дрожжей представлены белками Sup45 иSup35 соответственно (табл. 1.2; Frolova et al., 1994; Zhouravleva et al., 1995;Stansfield et al., 1995).

По своей пространственной структуре Sup45p напоминает молекулу тРНК (Song et al., 2000); N-концевой домен этого белка взаимодействует со стоп-кодоном, а C-концевой — с белком Sup35. В структуре Sup35pвыделяют три домена, за границы которых приняты три остатка метионина в положениях 1, 124 и 254. C-домен обеспечивает гидролиз ГТФ и взаимодействиес Sup45, и его последовательность консервативна у разных живых организмов исхожа с eEF1A, в то время как N- и M-домены более вариабельны и не являютсянеобходимыми для осуществления терминации трансляции (см.

Inge-Vechtomovet al., 2003). После гидролиза ГТФ eRF3 отсоединяется от комплекса, а eRF1остаётся в A-сайте. На последнем этапе АТФаза Rli1 гидролизует АТФ; происходит разборка комплекса и высвобождение Rli1p, тРНК и eRF1 (рис. 1.6; Dever,Green, 2012).I. Связывание комплексафакторов терминацииII. Гидролиз ГТФIII.

Связывание Rli1eRF3::ГДФБелокeRF3::ГТФeRF1E PARli1E PAIV. Высвобождение белкаV. Гидролиз АТФVI. Диссоциация субъединицрибосомыE PAeRF1тРНКМалаясубъединицарибосомыБольшаясубъединицарибосомыRli1БелокРисунок 1.6 — Общая схема терминации трансляции у S. cerevisiae. Вид со стороны большойсубъединицы рибосомы по Dever, Green, 2012.261.2.5. Деградация РНК с преждевременным стоп-кодономОтдельная молекула мРНК в цитоплазме может проходить через много раундов трансляции, однако рано или поздно подвергается деградации, котораяобычно начинается с укорочения поли(А)-последовательности с последующимудалением кэпа и разрушением эндонуклеазой Xrn1. Продолжительность жизнимРНК регулируется связанными с ней белками, часть из которых присоединяется ещё в ходе транскрипции (см.

Braun, Young, 2014). Тем не менее, некоторыемолекулы мРНК деградируют быстрее других. В клетке существует несколько систем деградации аберрантных мРНК, в том числе системы NSD (от англ.Non-Stop Decay, система деградации мРНК, не содержащих стоп-кодона), NGD(No-Go Decay, система деградации мРНК, при трансляции которых рибосомаостановилась) и NMD (от англ. Nonsense Mediated Decay, система деградациимРНК, содержащих преждевременный стоп-кодон). NMD могут подвергатьсякак продукты мутантных аллелей генов, так и нормальные мРНК (см. Kervestin,Jacobson, 2012).Основными участниками NMD являются белки Upf1, Upf2 и Upf3 (кодирующие их гены в соответствии с официальной номенклатурой S. cerevisiae называются NAM7, NMD2 и NMD3). Ключевую роль в этом процессе играет белок Upf1 — РНК-геликаза (белок, способный связываться с РНК и изменять еёвторичную структуру за счёт энергии гидролиза АТФ); сверхпродукция Upf1pспособна компенсировать снижение активности Upf2p или Upf3p, но не наоборот.