Диссертация (Анеуплоидия как механизм обратимого изменения супрессорного фенотипа (ISP) у дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 2
Описание файла
Файл "Диссертация" внутри архива находится в папке "Анеуплоидия как механизм обратимого изменения супрессорного фенотипа (ISP) у дрожжей saccharomyces cerevisiae". PDF-файл из архива "Анеуплоидия как механизм обратимого изменения супрессорного фенотипа (ISP) у дрожжей saccharomyces cerevisiae", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "биология" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве СПбГУ. Не смотря на прямую связь этого архива с СПбГУ, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата биологических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст 2 страницы из PDF
Известно, что её эффективность зависит от различныхфакторов. Снижение эффективности терминации приводит к нонсенс-супрессии — считыванию стоп-кодонов как значащих. Исследование посвящено дальнейшему изучению механизмов, обеспечивающих тонкую регуляцию эффективности терминации трансляции у дрожжей, на модели нонсенс-супрессии.Степень разработанности темы.Ранее было показано, что штаммы,несущие нонсенс-супрессорную мутацию sup35-25 (ген SUP35 кодирует фактортерминации трансляции eRF3), способны к спонтанному изменению фенотипас супрессорного на несупрессорный.
Природа возникающего несупрессорногофенотипа, была подробно исследована; было показано, что в основе этого изменения фенотипа лежит появление в клетке наследственного детерминанта, обозначенного [ISP+ ] (от англ. Inversion of Suppressor Phenotype) и проявляющегосходство с дрожжевыми прионами. Было показано также, что [ISP+ ] возникает,скорее всего, в результате прионного превращения транскрипционного фактора Sfp1. Вместе с тем, не вполне понятно, каким образом прионизация этоготранскрипционного фактора может приводить к снижению эффективности нонсенс-супрессии, то есть к увеличению эффективности терминации трансляции.Целью работы явилось дальнейшее изучение механизмов, лежащихв основе обратимого изменения супрессорного фенотипа (Isp) у дрожжейS. cerevisiae.В рамках поставленной цели были сформулированы следующие задачи:1.
Изучение влияния сверхэкспрессии генов, кодирующих известные прионногенные регуляторы транскрипции, на частоту появления клонов Isp+ в потомстве клонов Isp– ;2. Сравнение изменения экспрессии генов, сопровождающего переход от фенотипа Isp+ к фенотипу Isp– , с изменением экспрессии, вызванным делециейSFP1;83. Поиск генов, изменение уровня экспрессии которых может определять разницу фенотипов Isp+ и Isp– ;4. Анализ кариотипа независимо полученных клонов Isp+ и Isp– , направленныйна выявление особенностей, коррелирующих с фенотипом клона.Научная новизна. В представленной работе впервые показано, что эффективность нонсенс-супрессии может регулировать дупликация хромосомы II,несущей супрессируемые мутации his7-1 и lys2-87.
Кроме того, впервые обнаружено, что при воздействии гидрохлорида гуанидина может происходить отборанеуплоидных клонов, а под действием сверхэкспрессии SFP1 — возвращение кэуплоидному состоянию. Впервые показано влияние сверхэкспрессии SWI1 накариотип гетероталличного штамма.Теоретическая и практическая значимость работы. Представленная работа является целостным исследованием, сочетающим подходы молекулярнойгенетики и современных методов анализа данных. Полученные данные подчёркивают необходимость учёта дополнительных изменений генома, таких каканеуплоидия, при планировании исследований, непосредственно не связанныхс изучением стабильности генома.
Эти результаты углубляют понимание механизмов тонкой регуляции матричных процессов и могут быть использованыв курсах «Частная генетика дрожжей», «Генетический контроль трансляции» и«Прионы», преподаваемых на кафедре генетики и биотехнологии СПбГУ, а также аналогичных курсах в других учебных заведениях.Методология и методы исследования. В данной работе использован подход, объединяющий методы, традиционно используемые в генетике дрожжей,широкий круг методов молекулярной биологии и микроскопии, а также современные методы биоинформатики. Основной объект исследования — дрожжиS.
cerevisiae.Основные положения, выносимые на защиту. В изученной системе нонсенс-супрессорный фенотип может регулировать копийность хромосомы II: всеизученные клоны фенотипа Isp– характеризуются наличием дополнительнойхромосомы. Кроме того, некоторые клоны Isp– характеризуются также наличием дополнительной хромосомы IX и снижением экспрессии генов, контролирующих импорт ионов железа и метаболизм аминокислот.
Все изученные клоны Isp+содержат одну хромосому II; некоторые из них являются дисомиками по другим9хромосомам, но это не влияет на эффективность нонсенс-супрессии. Разницафенотипа между клонами Isp+ и Isp– частично объясняется дупликацией генов,являющихся мишенью нонсенс-супрессии, а также может усиливаться за счётувеличения дозы других генов, кодирующих участвующие в трансляции белки иРНК.
Токсическое действие гидрохлорида гуанидина может способствовать отбору дисомных по хромосоме II клонов, а сверхэкспрессия генов SFP1 или SWI1,напротив, приводить к нормализации кариотипа таких анеуплоидных клонов. Вслучае сверхэкспрессии SWI1 может также происходить диплоидизация клеток.Степень достоверности и апробация результатов. Основные результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на 9 российских имеждународных конференциях и опубликованы в 5 статьях в рецензируемыхнаучных изданиях.Объём и структура работы.
Диссертация состоит из введения, пятиглав и пяти приложений. Полный объём диссертации составляет 193 страницыс 57 рисунками и 20 таблицами. Список литературы содержит 336 наименований.10Глава 1. Обзор литературыФакторы, обеспечивающие эффективную терминацию трансляции удрожжей Saccharomyces cerevisiae, и их взаимодействиеУчитель: Дети, запишите предложение: «Рыба сидела на дереве».Ученик: А разве рыбы сидят на деревьях?Учитель: Ну...
Это была сумасшедшая рыба.Школьный анекдотцит. по: А. и Б. Стругацкие «Понедельник начинается в субботу»1.1. S. cerevisiae как объект генетикиДрожжи S. cerevisiae являются очень хорошо изученным модельным объектом клеточной биологии и генетики (см. Botstein, Fink, 2011). Как пишетКарл Линдегрен (Carl C. Lindegren), изучение дрожжевой клетки началось с постулированием клеточной теории, то есть с восьмидесятых годов XIX века.
Впервой половине XX века, когда была выявлена плоидность клеток, началосьизучение генетики дрожжей Saccharomyces cerevisiae (см. Lindegren, 1949). Ксередине XX века было картировано несколько десятков генов и описан жизненный цикл дрожжей. Изученные признаки относились как к макроскопическим свойствам колоний (цвет, структура), так и к физиологическим свойствамштаммов (способность или неспособность расти при отсутствии в питательнойсреде определённых веществ); кроме того, был получен ряд как спонтанных,так и индуцированных мутантов (Lindegren, 1949).
Вскоре после появления методов секвенирования ДНК Фредерика Сенгера (Sanger, Coulson, 1975; Sanger etal., 1977), а также Аллана Максама и Уолтера Гилберта (Maxam, Gilbert, 1977)появились первые последовательности дрожжевых генов, среди которых былигены рибосомных РНК (Valenzuela et al., 1977; Rubtsov et al., 1980), а позже и консервативные белок-кодирующие гены, например, актин (Gallwitz, Sures,1980). Примерно в то же время были изучены группы сцепления, включающие11уже известные гены, и сделан вывод о наличии у S. cerevisiae шестнадцати хромосом (см.
Инге-Вечтомов, Карпова, 1993; Duina et al., 2014). Этот вывод былвпоследствии подтверждён с помощью метода пульс-электрофореза, основанного на разделении молекул ДНК большой длины (порядка десятков тысяч пароснований или более) в агарозном геле с помощью периодической смены направления электрического поля. Следует отметить, что традиционные цитологические методы не слишком удобны в работе с S. cerevisiae, поскольку этоторганизм обладает сравнительно небольшими хромосомами, и это затрудняет ихмикроскопический анализ (см.
Инге-Вечтомов, Карпова, 1993). К 1992 году число известных генов дрожжей составляло уже около тысячи (см. Goffeau et al.,1996).Сравнительно небольшой размер генома и хорошая изученность стали причиной того, что геном S. cerevisiae стал первым полностью отсеквенированнымгеномом эукариотического организма. Последовательности каждой из 16 дрожжевых хромосом и митохондриального генома штамма S288C были определены совместными усилиями нескольких лабораторий; статьи выходили в период с 1992 по 1998 гг.
Эти последовательности до сих пор являются отправной точкой (референсом) для большинства исследований генома дрожжей и сохранены в базе данных дрожжевого генома (Saccharomyces Genome Database,yeastgenome.org) в почти неизменном виде, если не считать некоторых уточнений, связанных, в частности, с тем, что разные научные группы использовалиразные производные штамма S288C (Engel et al., 2014).При секвенировании генома было выявлено 6275 открытых рамок считывания (ORF), которые могут кодировать белки длиной не менее 99 аминокислот,а также несколько сотен генов, предположительно кодирующих РНК (Goffeauet al., 1996). Впоследствии существование большинства этих генов было подтверждено экспериментально.
Сейчас в базе данных дрожжевого генома указаны5133 подтверждённых ORF (http://yeastgenome.org/genomesnapshot по состояниюна август 2016). Кроме того, секвенирование позволило выявить ряд интересныхособенностей генома S. cerevisiae, таких как малое количество ORF с интронами(не более 4%) и событие полной дупликации генома, вероятно, имевшее местов эволюционной истории вида (Goffeau et al., 1996). Более подробное изучениеэтого вопроса позволило найти 55 дуплицированных участков, включающих 37612пар генов-паралогов (Wolfe, Shields, 1997), а недавно было высказано предположение, что дупликация генома следовала за спариванием клеток, принадлежащих к разным видам, и была необходима для восстановления фертильности (см.Wolfe, 2015).Сейчас известны последовательности генома нескольких сотен штаммовдрожжей (Wei et al., 2007; Ralser, Kuhl, 2012; Bergström et al., 2014; Song et al.,2015; Strope et al., 2015 и другие работы), и это число постоянно увеличивается.К сожалению, качество как исходных данных, так и их обработки не всегда высоко и сильно варьирует в зависимости от возможностей и целей авторов каждогоисследования.